Funktionelle Bewertung von Antikörper-sezernierenden B-Zellen mittels ELISpot-Assay

Antikörper-sezernierende B-Zellen (ASCs) sind differenzierte B-Zellen, die Antikörper-Isotypen, einschließlich IgG und IgM, sezernieren, um den Schutz vor Krankheitserregern zu gewährleisten.

Um eine funktionelle Bewertung von ASCs in vitro durchzuführen, beginnen Sie mit dem Enzyme-linked Immunosorbent Spot Assay. Nehmen Sie eine ELISpot-Platte, die an der Basis eine aktivierte Polyvinylidenfluoridmembran enthält.

Inkubieren Sie die Vertiefungen mit polyklonalen Antikörperfragmenten, die ausschließlich Fab-Regionen ohne die Fc-Region des Antikörpers enthalten. Jede Fab-Region verfügt über eine Bindungsstelle für spezifische Antikörper-Isotypen – IgG oder IgM, was die Identifizierung beider Isotypen ermöglicht.

Während der Inkubation heften sich die Antikörperfragmente an die Membran, was zu einer Immobilisierung führt.

Überlagern Sie die Vertiefungen mit Blocklösungen, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Besiedeln Sie die Platte mit aktivierten Antikörper-sezernierenden B-Zellen und inkubieren Sie. Die ASCs sezernieren verschiedene Isotypen, darunter IgG und IgM, die an die membrangebundenen Antikörperfragmente binden.

Waschen Sie die Platte mit einem Puffer, um ungebundene sekretierte Antikörper zu entfernen. Behandeln Sie einige Vertiefungen mit enzymkonjugierten Nachweisantikörpern für IgM und andere mit Nachweisantikörpern für IgG und inkubieren Sie.

Die Nachweisantikörper binden an ihre jeweiligen Isotypen und bilden Immunkomplexe.

Fügen Sie allen Vertiefungen kolorimetrische Substrate hinzu, die mit den Enzymen interagieren und violette Flecken auf der Membran erzeugen. Fügen Sie eine Stopplösung hinzu, um die Reaktion zu stoppen.

Der farbige Fleck, der in jeder Vertiefung produziert wird, zeigt das Vorhandensein des Isotyps des spezifischen Antikörpers an, der mit der sekretorischen Aktivität der B-Zellen korreliert.

Wenn alle Zellen geerntet wurden, säen Sie die Untergruppen in einzelne Vertiefungen einer 12-Well-Zellkulturplatte mit einer Konzentration von 1 bis 10 x 10 5 Zellen pro Milliliter in frischem RPMI-Medium. Anschließend werden die B-Zellen mit 5 Mikrogramm CpG (ODN 2006) pro 1 x 10⁶ Zellen pro Milliliter pro Well im Zellkultur-Inkubator für fünf Tage aktiviert.

Am Ende der Aktivierung 30 Mikroliter 35 % Ethanol in destilliertem Wasser für 30 Sekunden in jede Vertiefung der ELISpot-Platten geben. Ersetzen Sie dann das Ethanol in jeder Vertiefung durch 150 Mikroliter autoklaviertes, doppelt destilliertes Wasser und inkubieren Sie die Platten 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, um das restliche Ethanol zu entfernen. Führen Sie eine PBS-Wäsche durch, gefolgt von der Zugabe von 50 Mikrolitern des polyklonalen F(ab')2-Fragments von Anti-Human-Ig in jede Vertiefung

Waschen Sie die Teller zweimal mit PBS, wie gerade gezeigt. Blockieren Sie die unspezifische Bindung in jeder Vertiefung mit 200 Mikrolitern frischem PBS mit BSA für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Nach einer weiteren PBS-Waschserie inkubieren Sie die Vertiefungen in 100 Mikrolitern frischem RPMI 1640 Medium bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie dann das Medium in jeder ELISpot-Vertiefung durch die entsprechende Anzahl aktivierter B-Zellen.

Bringen Sie das endgültige Volumen jeder Vertiefung auf 150 Mikroliter mit frischem RPMI-Medium. Stellen Sie die ELISpot-Platte dann für 8 bis 14 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück. Entsorgen Sie am Ende der Inkubationszeit das Medium und waschen Sie die Vertiefungen mit 200 Mikrolitern PBS plus Tween 20 für fünf 3-Minuten-Wäschen.

Geben Sie nach dem letzten Waschen die entsprechenden Nachweisantikörper in die entsprechenden Vertiefungen und inkubieren Sie die Platten zwei Stunden lang im Dunkeln. Geben Sie nach einer weiteren PBS-Waschserie 50 Mikroliter BCIP/NBT-Substrat für 5 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur in jede Vertiefung

Wenn violette Flecken erscheinen, stoppen Sie die Reaktion mit 100 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser pro Vertiefung und spülen Sie die Platte mit fließendem Leitungswasser aus. Anschließend trocknen Sie die ELISpot-Membranen lichtgeschützt an der Luft.