Identifizierung regulatorischer T-Zell-Untergruppen aus murinen pankreasdrainierenden Lymphknoten

Regulatorische T-Zellen oder Tregs sind eine spezialisierte T-Zell-Subpopulation, die immunsuppressive Wirkungen ausübt, um die Homöostase des Immunsystems zu vermitteln. Tregs exprimieren die Zelloberflächenmarker CD4, CD25 und Neuropilin 1, Nrp1 sowie die nukleären Transkriptionsfaktoren Forkhead Box P3, Foxp3 und Helios.

Um Tregs aus pankreasdrainierenden Lymphknoten (PDLNs) der Maus zu isolieren, legen Sie ein Metallnetz über eine konische Röhre. Legen Sie die PDLNs auf das Netz und schleifen Sie das Gewebe, um es mechanisch zu dissoziieren. Geben Sie ein geeignetes Medium über das Netz und spülen Sie die Zellen in das Rohr.

Zentrifuge, Entfernung abgestorbener Zellen und Zelltrümmer. Resuspendieren Sie die lebensfähigen Zellen im Medium. Führen Sie die Zellen durch eine Zellsiebkappe, die an einem Röhrchen mit rundem Boden befestigt ist, um eine homogene Einzelzellsuspension zu erhalten, bei der alle verbleibenden Zellklumpen entfernt werden.

Fügen Sie Fluorochrom-konjugierte Anti-CD4-, Anti-CD25- und Anti-Nrp1-Antikörper hinzu. Die anti-CD4- und anti-CD25-Antikörper binden an ihre jeweiligen Zelloberflächenantigene auf Tregs. Gleichzeitig bindet Anti-Nrp1 an die Nrp1-Rezeptoren.

Behandeln Sie die Zellen mit einem geeigneten Permeabilisierungsfixierungspuffer, fixieren Sie die Zellen und permeabilisieren Sie die Zell- und Kernmembranen. Fügen Sie Fluorochrom-konjugierte Antikörper hinzu, die auf Foxp3 und Helios abzielen.

Die permeabilisierten Membranen ermöglichen es den Antikörpern, in die Zellen einzudringen und an ihre jeweiligen intranukleären Ziele zu binden. Analysieren Sie die Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie.

Tregs zeichnen sich durch die positive Zelloberflächenexpression von CD4, CD25 und Nrp1 sowie den nukleären Transkriptionsfaktoren Foxp3 und Helios aus.

Legen Sie zunächst ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen in ein Rack. Legen Sie ein steriles 250-Mikrometer-Metallnetz über das Röhrchen. Spülen Sie das Netz mit 1 Milliliter RPMI aus. Übertragen Sie als Nächstes die Lymphknoten in das Metallnetz und schleifen Sie sie mit einer Pinzette durch das Netz. Tragen Sie 1 Milliliter RPMI auf das Netz auf, um die Zellen in das Röhrchen zu spülen. Wiederholen Sie diesen Vorgang des Übertragens und Schleifens der Lymphknoten dreimal für jede Probe und entfernen Sie dann das Netz.

Die Röhrchen bei 433 x g und bei 4 Grad Celsius 5 Minuten zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in etwa 5 Millilitern RPMI, dann füllen Sie die Röhrchen mit RPMI. Wiederholen Sie diesen Vorgang vom Zentrifugieren der Proben bis zum einmaligen Befüllen des Röhrchens mit RPMI.

Die Röhrchen erneut bei 433 x g und bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 Millilitern RPMI. 2 Milliliter der Zellsuspension werden in 5-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden und Zellsiebkappen überführt.

Zuerst zentrifugieren Sie die Zellsuspension aus den PDLN-Proben bei 433 x g und bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand. Färben Sie die Zellen mit Oberflächenantikörpern, wie im Textprotokoll beschrieben, und inkubieren Sie die Röhrchen 40 Minuten lang auf Eis.

Geben Sie als Nächstes 200 Mikroliter FACS-Puffer in jedes Röhrchen. Bei 433 x g und 4 Grad Celsius 5 Minuten lang zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Vorgang – fügen Sie den Puffer hinzu, zentrifugieren Sie ihn und verwerfen Sie den Überstand einmal. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern Permeabilisierungsfixierungspuffer, um die Zellen zu fixieren und zu permeabilisieren.

Stellen Sie die Röhrchen über Nacht bei 4 Grad Celsius in den Kühlschrank. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Zellsuspension aus den PDLN-Proben bei 433 x g und bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern Permeabilisierungswaschpuffer. Die Zellen werden erneut bei 433 x g und bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen.

Färben Sie die Zellen mit intrazellulären Antikörpern, wie im Textprotokoll beschrieben. Inkubieren Sie die Röhrchen 1 Stunde lang auf Eis. Geben Sie danach 500 Mikroliter Permeabilisierungs-Waschpuffer in jedes Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 433 x g und bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Permeabilisierungs-Waschpuffer.

Zentrifugieren Sie erneut bei 433 x g bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in 300 Mikrolitern FACS-Puffer. Analysieren Sie dann die Zellen auf einem Durchflusszytometer, wie im Textprotokoll beschrieben.