JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Immunologie
0 Aufrufe • 3:42 Min. • July 8th, 2025
Marginierende Leber-, MH- und Leukozyten haften an den Wänden spezialisierter Leberblutgefäße oder Sinusoide, die von Endothelzellen ausgekleidet sind. MH-Leukozyten werden als Reaktion auf Entzündungen an das umgebende Gewebe rekrutiert.
Um MH-Leukozyten zu gewinnen, beginnen Sie mit einer euthanasierten Maus in Rückenlage. Schnitten Sie die Bauch- und Brusthöhle und legen Sie die Leber und den Herz-Lungen-Komplex frei.
Verlagern Sie den Darm, um die Pfortader freizulegen, die Blut aus der Milz, dem Magen-Darm-Trakt und den zugehörigen Organen zur Leber transportiert. Führen Sie eine Nadel, die mit einer Schlauchpumpe verbunden ist, in die Pfortader ein.
Präparieren Sie die untere Hohlvene – ein großes Blutgefäß, das sauerstoffarmes Blut von der Leber zum Herzen transportiert – um das Perfusat während der Perfusion zu sammeln.
Perfundierte der Leber durch die Pfortader mit einem Puffer, der Antikoagulans bei niedriger Flussrate für kurze Zeit enthält. Dieser Schritt hilft, Blut mit nicht anhaftenden Zellen aus den Blutgefäßen der Leber durch den Ausfluss der unteren Hohlvene zu entfernen. Entsorgen Sie dieses blutkontaminierte Perfusat.
Perfusion jetzt mit einer höheren Durchflussrate. Die forcierte Perfusion bei erhöhter Strömung und Schergeschwindigkeit stört die Adhäsion zwischen den MH-Leukozyten und der Blutgefäßinnenauskleidung und löst so die MH-Leukozyten von der sinusförmigen Wand.
Sammeln Sie das Perfusat, das MH-Leukozyten und andere Blutzellen enthält, und überführen Sie es in ein frisches Röhrchen. Zentrifuge. Resuspendieren Sie das Pellet mit MH-Leukozyten für die weitere nachgelagerte Analyse.
Um Maus-Marginating-Leber-Leukozyten zu sammeln, verwenden Sie unmittelbar nach Beendigung der Atmung eine sterile Schere und Zahngewebezange, um einen Mittellinien-Bauchschnitt bis zum Xiphoid-Prozess vorzunehmen. Als nächstes hebst du das Brustbein mit der Pinzette an und schneidest das Zwerchfell und den Brustkorb vorsichtig auf beiden Seiten durch.
Klemmen Sie ein Blutstillungsmittel auf das Brustbein und falten Sie den Brustkorb rostral, um den Herz-Lungen-Komplex freizulegen. Bewegen Sie den Darm außerhalb der Bauchhöhle nach links vom Tier, wodurch die Pfortader freigelegt wird. Schließen Sie dann eine 30-Gauge-Nadel an eine Peristaltikpumpe an und führen Sie sie in die Pfortader rostral zur Milzvene ein.
Schneiden Sie die untere Hohlvene oberhalb des Zwerchfells, um die Drainage und Sammlung des Perfusats aus der Brusthöhle zu ermöglichen. Schalten Sie dann die Peristaltikpumpe mit einer Geschwindigkeit von etwa 3 Millilitern pro Minute ein und sammeln Sie die ersten Milliliter blutkontaminiertes Perfusat aus dem Brustraumbecken. Wenn 3 Milliliter aufgefangen wurden, schalten Sie die Pumpe aus.
Nach dem Einführen einer 21-Gauge-Schmetterlingsnadel, die mit einer 10-Milliliter-Spritze verbunden ist, wird die Perfusion mit einer Geschwindigkeit von bis zu 4 Millilitern pro Minute wieder eingeleitet, bis 10 Milliliter Perfusat aus der Brusthöhle gesammelt werden. Wenn sich die Leber hellbraun färbt, beenden Sie die Durchblutung. Übertragen Sie anschließend das Perfusat in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie es und saugen Sie dann den Überstand an.