Warum ist eine Kollagenasebehandlung für die Lymphozytenisolierung aus Lebergewebe erforderlich?

Kollagenase verdaut die extrazelluläre Matrix, um eingebettete Lymphozyten und andere mononukleäre Zellen aus dem kollagenreichen Leberparenchym freizusetzen. Dieser enzymatische Schritt ist notwendig, um die Gewebesteifigkeit zu überwinden und eine effiziente Zell-Dissociation vor der Dichtegradienten-Trennung zu ermöglichen.

Wie verbessert die Trennung mit PVP-beschichteten Silicabeads die Lymphozytengewinnung?

PVP-beschichtete Kieselgelkügelchen binden selektiv Adipozyten und fettenthaltende Zellen, wodurch deren Entfernung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit ermöglicht wird. Dieser Ausschöpfungsschritt verringert die Kontamination und bereichert die Lymphozytenpopulation im Überstand für die anschließende Dichtegradientenzentrifugation.

Was bewirkt die Gewinnung der Interphase nach der Dichtegradientenzentrifugation?

Durch das Sammeln der Interphase werden Lymphozyten, einschließlich NK-Zellen, basierend auf ihrer Schwimmdichte zwischen Plasma und dem Gradientenmedium isoliert. Bei diesem Schritt werden mononukleäre Zellen von Erythrozyten und Granulozyten getrennt, die sich am Boden des Gefäßes absetzen.

Warum ist die Isolierung von Lymphozyten aus Lebergewebe für Studien zur Expansion natürlicher Killerzellen (NK-Zellen) wertvoll?

Leberstammige Lymphozyten stellen eine Quelle für im Gewebe residente NK-Zellen dar, die in selektiven Kulturmedien zur Untersuchung ihrer Effektorfunktionen expandiert werden können. Die Verwendung von gereinigten Lymphozyten als Ausgangspunkt gewährleistet eine konsistente Zellzahl für die Expansionsprotokolle und verringert die Variabilität in nachgeschalteten Zytotoxizitätsassays.

Welche analytischen Ausgaben können aus isolierten Leberlymphozyten zur Unterstützung der Target-Validierung generiert werden?

Isolierte Lymphozyten können auf die Expression von Oberflächenmarkern (z. B. CD56, CD16) sowie auf funktionelle Reaktionen wie Degranulation (CD107a) und Zytokinausschüttung untersucht werden. Diese Messungen ermöglichen einen quantitativen Vergleich der NK-Zell-Aktivität unter verschiedenen experimentellen Bedingungen oder nach Behandlung mit Wirkstoffen.

Isolierung natürlicher Killerzellen aus Lebergewebe für die selektive Expansion

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologie

0 Ansichten • 4:17 Min. • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um natürliche Killerzellen oder NK-Zellen zu isolieren – spezialisierte weiße Blutkörperchen, die an der angeborenen Immunität beteiligt sind, beginnen Sie mit menschlichem Lebergewebe, das verschiedene Zellpopulationen enthält, darunter fetthaltige Zellen, Erythrozyten, Granulozyten, Lymphozyten und andere assoziierte Zellen, die in einer kollagenreichen extrazellulären Matrix oder EZM eingeschlossen sind.

Zerkleinern Sie das Gewebe in kleine Stücke und geben Sie sie in ein Röhrchen, das Kollagenase enthält – ein proteolytisches Enzym. Kollagenase spaltet das Kollagen, zerstört die Matrix und lockert die EZM-gebundenen Zellen.

Führen Sie den Schlauch in einen Gewebedissoziator ein. Diese mechanische Dissoziation zersetzt ECM weiter, um lose gebundene Zellen in die Lösung freizusetzen. Filtern Sie den Inhalt, um unverdautes Gewebe und EZM-Fragmente zu entfernen, und sammeln Sie das Filtrat, das verschiedene Zellen enthält.

Resuspendieren Sie die Zellen in einen Puffer, der Polyvinylpyrrolidon oder PVP-beschichtete Siliziumdioxidkügelchen enthält. Die PVP-Kügelchen binden selektiv an fetthaltige Zellen und trennen diese so effektiv vom Rest der Zellen.

Zentrifugieren Sie bei niedriger Geschwindigkeit, um die Zellpopulation zu pelletieren; entsorgen Sie den Überstand mit Ablagerungen und perlengebundenen Fettzellen. Resuspendieren Sie das Pellet und legen Sie die Zellsuspension auf ein Rohr mit einem Dichtegradientenmedium, um die Zellen basierend auf ihrer Dichte zu trennen.

Zentrifugieren Sie bei niedriger Geschwindigkeit. Die Erythrozyten und Granulozyten mit höherer Dichte siedeln sich am Boden an, während die Lymphozyten an der Zwischenphase zwischen zwei Flüssigkeiten erscheinen.

Sammeln Sie die Zellen aus der Interphase und kultivieren Sie sie in einem selektiven Medium für die NK-Zellexpansion.

Beginnen Sie mit der Identifizierung und Durchtrennung der lebensfähigen Gewebebereiche mit sterilen chirurgischen Geräten, um Lymphozyten zu gewinnen. Legen Sie dann das geschnittene Gewebe in 30 Milliliter HBSS ohne Kalzium oder Magnesium und bewahren Sie das Gewebe auf Eis auf, bis es für die Isolierung bereit ist.

Zerkleinern Sie das Gewebe in einer Biosicherheitswerkbank mit sterilen Rasierklingen und Pinzetten in weniger als 0,5 Zentimeter große Würfel. Legen Sie die gehackten Gewebestücke – nicht mehr als 4 Gramm – in die Gewebedissoziatorröhrchen und fügen Sie den Gewebestücken 10 Milliliter Kollagenase IV hinzu.

Um das Gewebe gründlich zu zerkleinern, behandeln Sie die Gewebedissoziatorröhrchen in einem Gewebedissoziator bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Röhrchen aus dem Gewebedissoziator entfernt haben, zerkleinern Sie das zerkleinerte Gewebe mit dem hinteren Ende einer 5-Milliliter-Spritze durch ein 40-Mikron-Nylon-Zellsieb. Entsorgen Sie die großen, unverdauten Fragmente.

Schleudern Sie den gesammelten Eluenten bei 400 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur herunter und aspirieren Sie den Überstand, bevor Sie die Zellpellets in 30 % Polyvinylpyrrolidon-beschichtetem Siliziumdioxid resuspendieren, um die Fettzellen zu entfernen. Schleudern Sie die Zellen wie beschrieben herunter, bevor Sie das Zellpellet in 9 Millilitern R-10-Medium resuspendieren.

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

Zuletzt aktualisiert: 15 August 2026

Isolierung natürlicher Killerzellen aus Lebergewebe für die selektive Expansion

Übersicht

Wesentliche Studienkomponenten

Bereich der Wissenschaft

Hintergrund

Zweck der Studie

Verwendete Methoden

Hauptergebnisse

Schlussfolgerungen

Häufig gestellte Fragen

Aussagekräftige Relevanz für die Industrie

Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung

Frühe Entdeckung und Zielvalidierung

Screening und Assay-Entwicklung

Translationale und präklinische Forschung

Pipeline- und Workflow-Integration

Operative und unternehmerische Auswirkungen

Durchführungsaspekte

Biopharma-Häufig gestellte Fragen

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Isolierung und Erweiterung zytotoxischer Cytokin-induzierter Killer-T-Zellen zur Krebsbehandlung

Analyse des menschlichen natürlichen Killerzellstoffwechsels

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Isolierung von CD133 + Leber-Stammzellen für die klonale Expansion

Ex-vivo-Expansion natürlicher Killerzellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes

Isolierung invarianter natürlicher Killer-T-Zellen aus einem Mausmodell

Kupffer Zelle Isolierung für die Toxizität von Nanopartikeln Testing

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus