Ex-vivo-Expansion natürlicher Killerzellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes

Natürliche Killerzellen, NK-Zellen, sind große granuläre Lymphozyten, die Tumore und mikrobielle Infektionen eliminieren.

Für die ex vivo NK-Zellexpansion nehmen Sie eine Suspension von mononukleären Zellen des peripheren Blutes, PBMCs, die eine heterogene Population von Lymphozyten, einschließlich NK-Zellen, enthalten. Fügen Sie bestrahlte Feederzellen hinzu – nicht-proliferierende lymphoblastoide Zellen –, die membrangebundenes Interleukin 21, mIL-21, exprimieren, das zur Aktivierung und Expansion von NK-Zellen erforderlich ist.

Geben Sie die Co-Kultur in eine spezielle Kulturvertiefung mit einer gasdurchlässigen Membran am Boden, die den Gasaustausch ermöglicht. Die Zellen setzen sich ab und vermehren sich über einen längeren Zeitraum, ohne dass eine Passage erforderlich ist.

Fügen Sie Interleukin 2, IL-2 und Interleukin 15, IL-15 hinzu – Zytokine für die Proliferation von NK-Zellen. Inkubieren Sie für einen angemessenen Zeitraum unter physiologischen Bedingungen.

mIL-21 auf den Feeder-Zellen bindet an einen spezifischen heterodimeren Rezeptor auf den NK-Zellen. Exogene IL-15 und IL-2 binden an ihre jeweiligen Rezeptoren. Die Bindung induziert verschiedene nachgeschaltete Signalwege – die Aktivierung der Genexpression – begrenzt die zelluläre Seneszenz und führt zu einer verlängerten NK-Zellproliferation.

Beurteilen Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie die Expansion der NK-Zellen in regelmäßigen Zeitabständen.

Stellen Sie die aufgezeichneten Daten grafisch dar, um die Expansionsrate der Zellen und ihre Reinheit zu analysieren – selektives Wachstum des Ziel-NK-Zelltyps. Die vielfältige Ausdehnung über die Inkubationszeit deutet auf eine anhaltende Proliferation bei gleichbleibend hoher Reinheit hin.

Waschen Sie die mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) und 100 gammabestrahlte 221-mIL-21-Zellen separat durch Zentrifugation bei 400 g für 5 Minuten mit 10 Millilitern R-10-Medien.

Bewahren Sie nach der Zentrifugation 1 x 10⁶ PBMC für die Durchflusszytometrie auf und mischen Sie 5 x 10⁶ PBMC mit 10 x 10⁶ 100 gammabestrahlten 221-mIL-21-Zellen in einer speziellen 6-Well-Platte. Geben Sie 30 Milliliter R-10-Medien, die mit humanem Interleukin-2 und humanem Interleukin-15 ergänzt sind, auf dieselbe 6-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, wobei das Medium alle drei bis vier Tage ausgetauscht wird.

Während der Inkubation ist die Gesamtzahl der natürlichen Killer- oder PBNK-Zellen des peripheren Blutes und die Lebensfähigkeit zu erfassen und alle drei bis vier Tage eine Durchflusszytometrie durchzuführen, um die Expansionsrate der NK-Zellen zu berechnen.