CD-Markererkennung von humanen Zytokin-induzierten Killerzellen mittels Durchflusszytometrie

Zytokin-induzierte Killerzellen, CIK-Zellen, sind heterogene Immunzellpopulationen, die ex vivo aus Kulturen mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) erzeugt werden, die mit spezifischen Zytokinen und monoklonalen Antikörpern stimuliert werden. CIK-Zellen umfassen Zellpopulationen, darunter CD3+CD56+ NK-T-Zellen, CD3+CD56- T-Zellen und CD3-CD56+ NK-Zellen.

Um den CIK-Zellanteil zu bestimmen, beginnen Sie mit Röhrchen, die eine PBMC-abgeleitete CIK-Zellsuspension enthalten. Anti-CD3- und Anti-CD56-Antikörper, die an verschiedene Fluorophore konjugiert sind, und deren Mischung in die dafür vorgesehenen Röhrchen geben. Geben Sie Isotyp-Kontrollantikörper, die an ähnliche Fluorophore wie spezifische Antikörper konjugiert sind, in andere Röhrchen.

Fluoreszenzmarkierte Anti-CD3- und Anti-CD56-Antikörper erkennen und binden an CD3 und CD56, die auf CIK-Zellpopulationen exprimiert werden. Isotyp-Kontrollantikörpern fehlt die Zielantigenspezifität, was unspezifische Hintergrundsignalmessungen erleichtert.

Pipettieren Sie die Zellen in Röhrchen mit rundem Boden und Zellsiebkappen, die bei der Entfernung von Zellaggregaten helfen. Laden Sie die Röhrchen in ein Durchflusszytometer-Karussell. Während des Laufs durchläuft jede Zelle den Kanal und trifft auf die Laserstrahlen, wodurch das Licht gestreut wird.

Ein Detektor misst die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts, die auf die Zellgröße hinweist, ein anderer misst die Intensität des seitlichen Streulichts senkrecht zum Laserstrahl, was auf die Zellgranularität hindeutet. Zusammen helfen diese Informationen bei der Identifizierung der Immunzellpopulation.

Gleichzeitig regen Laserstrahlen bestimmter Anregungswellenlängen die Fluorophor-konjugierten Antikörper auf den Zellen an, wodurch fluoreszierende Signalemissionen verursacht werden, die detektiert werden.

Die Analyse spezifischer Fluoreszenzintensitäten an den Zellen bestimmt den Anteil der CIK-Zell-Subpopulationen.

Beginnen Sie diese Prozedur mit der Vorbereitung von CIK-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Waschen Sie dann die CIK-Zellen mit 10 Millilitern sterilem PBS. 10 Minuten bei 300 mal g und 18 bis 20 Grad Celsius zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 5 Millilitern PBS. Zählen Sie die Zellzahlen und testen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit dem Trypanblau-Ausschluss-Assay.

Aliquotieren Sie die CIK-Zellen in sechs sterile 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einer Dichte von etwa 0,5 bis 1 Million Zellen pro Milliliter PBS. Beschriften und behandeln Sie die Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie die CIK-Zellen vorsichtig mit den Antikörpern, indem Sie mindestens dreimal mit einer sterilen 1-Milliliter-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 300 mal g und 18 bis 20 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation wird der Überstand aspiriert und das Zellpellet mit 1 Milliliter PBS resuspendiert. Pipettieren Sie die Zellen dann mindestens dreimal vorsichtig mit einer sterilen 1-Milliliter-Pipette auf und ab. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles 5-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit einer Zellsiebkappe, indem Sie vorsichtig durch die Kappe pipettieren. Lege dann die Röhren der Reihe nach auf das Karussell.

Öffnen Sie die Durchflusszytometrie-Analysesoftware und erstellen Sie einen experimentellen Ordner. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Neue Probe", um dem Experiment eine Probe und ein Röhrchen hinzuzufügen. Benennen Sie die Röhren wie im Textprotokoll aufgeführt.

Um ein Scatter-Gating-System für die CIK-Zellpopulationen zu erstellen, wählen Sie zunächst Röhre 1 aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um ein FSC-A/SSC-A-Diagramm zu erstellen. Zeichnen Sie ein rechteckiges Gate über die gesamte Zellpopulation mit einem FSC-A-Schwellenwert von mehr als 5.000, um Zellablagerungen auszuschließen.

Wählen Sie den Parameter FSC-A/FSC-H für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Polygon-Gate um alle einzelnen Zellen. Wählen Sie für das neue Histogrammdiagramm die Parameter count versus FITC-konjugiert (CD3) und count versus APC-konjugiert (CD56) aus. Wählen Sie den Parameter FITC-konjugiert (CD3) versus APC-konjugiert (CD56) für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Vier-Quadranten-Gate, um die vier Subpopulationen zu definieren.

Notieren Sie die Daten von 20.000 einzelnen Zellen in jeder Probe. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Probe laden", um zuerst die leere Kontrollprobe zu analysieren. Identifizieren Sie die gesamte CIK-Zellpopulation mithilfe der Kanalparameter CD56 und CD3. Öffnen Sie die Dateien mit den statistischen Werten der einzelnen Probe, um CIK-Zellpopulationen zu analysieren, und drucken Sie sie in Analysedateien nach.