Assay zur Identifizierung der Interferon-gamma-Sekretion in lymphatischen Organen der Maus

Interferon-gamma oder IFN-γ, ein Zytokin, das von den T-Zellen der Lymphozyten und den natürlichen Killerzellen oder NK-Zellen sezerniert wird, vermittelt die Immunantwort gegen Krankheitserreger.

Um die In-situ-Produktion von IFN-γ zu untersuchen, nehmen Sie eine Maus, der fluoreszenzmarkierte T-Zellen transplantiert wurden, die so verändert wurden, dass sie einen Rezeptor exprimieren, der Ovalbumin erkennt - ein Modellantigen.

Nehmen Sie eine Suspension pathogener Bakterien – genetisch verändert, um Ovalbumin zu exprimieren – und injizieren Sie sie intravenös in die Maus, was zu einer systemischen Infektion führt. Die zirkulierenden Bakterien gelangen in die Milz – ein sekundäres lymphatisches Organ –, das die Entfernung von Krankheitserregern unterstützt, indem es die Interaktion mit Immunzellen erleichtert.

Antigen-präsentierende Zellen umhüllen die Bakterien und zeigen das Antigen an. T-Zellen binden über dessen Rezeptor an das Antigen, werden aktiviert und produzieren IFN-γ.

Makrophagenzellen, die mit den Bakterien infiziert sind, setzen Immunmediatoren frei und regulieren aktivierende Liganden auf ihrer Oberfläche hoch. Bei Interaktion mit diesen Signalen werden NK-Zellen aktiviert und produzieren IFN-γ.

Injizieren Sie einen intrazellulären Proteintransporthemmer, um die IFN-γ-Sekretion einzuschränken und dessen intrazelluläre Akkumulation zu verursachen.

Ernte die Milz der Maus. Fixiere das Gewebe und friere es ein, um das Schneiden zu erleichtern. Erzeugen Sie mit einem Kryomikrotom dünne Gewebeschnitte und platzieren Sie sie auf Objektträgern. Fügen Sie NK-Zell-spezifische Antikörper hinzu, die an die Oberflächenmarker binden, und IFN-γ-spezifische Antikörper, die das intrazelluläre IFN-γ färben. Diese Antikörper sind mit verschiedenen Fluorophoren markiert.

Legen Sie den Objektträger unter ein Fluoreszenzmikroskop, um IFN-γ in den NK-Zellen und T-Zellen nachzuweisen.

Entsorgen Sie die Fixierlösung und fügen Sie 5 Milliliter PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren hinzu. Ersetzen Sie dann das PBS durch 5 Milliliter 30% Saccharose und inkubieren Sie es 12 bis 24 Stunden lang, um die Gewebemorphologie zu erhalten. Nun sinkt das Organ am Boden der Platte.

Um die Probe einzufrieren, geben Sie Trockeneis in ein großes Gefäß und stellen Sie ein kleineres Gefäß hinein, das etwa 50 Milliliter reines Methanol und einige Stücke Trockeneis enthält. Trocknen Sie die Milz vorsichtig auf einem fusselfreien Tuch. Tröpfe einen Tropfen OCT-Paste auf den Boden der Basisform und lege die Milz in die Form. Achte darauf, dass du keine Blasen produzierst.

Geben Sie etwa 1 Milliliter OCT über die Milz. Legen Sie die Grundform mit einer Pinzette auf die Oberfläche des Methanols im Trockeneisbad und achten Sie darauf, dass das Methanol das OCG nicht berührt. Das OCT verdickt sich und wird weiß, wenn es eingefroren wird. Denken Sie daran, das Gewebe so schnell wie möglich einzufrieren, um Artefakte zu minimieren.

Auf einem Kryo-Mikrotom auf eine Temperatur von minus 21 Grad Celsius eingestellt. Schneiden Sie das Gewebe auf die gewünschte Dicke von etwa 10 Mikrometern. Verwenden Sie einen Pinsel, um Schnitte auf Glasobjektträger zu sammeln und visuell zu inspizieren. Lassen Sie die Abschnitte auf Raumtemperatur kommen.

Zeichnen Sie mit einem Flüssigblocker, z. B. einem PAP-Stift, einen Kreis um den Gewebeabschnitt außerhalb des OCT. Sobald das Gewebe getrocknet ist, rehydrieren Sie die Probe, indem Sie 5 Minuten lang 100 Mikroliter PBS auf den Gewebeabschnitt tropfen. Entfernen Sie dann das PBS durch Aspiration aus dem Schnitt und fügen Sie 100 Mikroliter Blockierungslösung pro Probenabschnitt hinzu. In einer abgedeckten Nasskammer mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Um mit Primärantikörpern zu färben, ersetzen Sie die Blockierungslösung durch die vorbereitete Primärantikörpermischung für jede Probe. Inkubieren Sie vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 Grad Celsius in einer abgedeckten Nasskammer, bevor Sie es gemäß Manuskript waschen.

Verdünnen Sie nun die interessierenden Sekundärantikörper auf eine optimale Konzentration, normalerweise 2,5 Mikrogramm pro Milliliter in der Blockierungslösung. Entfernen Sie die endgültige Waschlösung aus dem Schnitt, geben Sie den vorbereiteten Sekundärantikörpermix auf den Schnitt und inkubieren Sie ihn ein bis vier Stunden lang bei Raumtemperatur in einer abgedeckten, nassen Kammer.

Nach dem Waschen mit Waschpuffer gemäß Manuskript die Waschlösung entfernen und eine abschließende Wäsche mit PBS durchführen. Die phosphatgepufferte Kochsalzlösung aspirieren und das restliche PBS verdampfen lassen, ohne dass der Abschnitt vollständig austrocknet.

Zeichnen Sie einen Kreis um den Abschnitt auf der Rückseite der Folie. Geben Sie dann einen Tropfen des Eindeckmediums auf die Probe, stellen Sie sicher, dass das Medium den gesamten Abschnitt bedeckt, und platzieren Sie vorsichtig ein Deckglas darauf. Lassen Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln polymerisieren.

Legen Sie den Objektträger morgens unter ein invertiertes spektrales Laser-Scanning-Mikroskop. Passen Sie die Objektive auf 10x/NA 0,40 oder 60x/NA 1,4 für die Analyse der subzellulären Lokalisation von Zytokinen an.