JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 4:25 Min. • July 8th, 2025
Die Samenkanälchen der Hoden enthalten Sertoli-Zellen, die die Keimzellen ernähren. Sertoli-Zellen sind über Tight Junctions miteinander verbunden und fest an die hyaluronsäurereiche Basalmatrix gebunden. Diese Anordnung von Sertoli-Zellen reguliert den Eintritt der Immunzellen in den Tubulus und schützt die sich entwickelnden Keimzellen vor dem Abbau.
Um Sertoli-Zellen zu isolieren, beginnen Sie mit einem Röhrchen mit teilweise verdauten Samenkanälchen, die aus Maushoden stammen. Diesen Tubuli fehlen peritubuläre Zellen – glatte Muskelzellen, die die Samenkanälchen umgeben.
Behandeln Sie die Tubuli mit einem Enzymcocktail, der Hyaluronidase – essentiell für die Hydrolyse von Hyaluronsäure – und DNase enthält.
Hyaluronidasen dringen in die Tubuli ein und spalten Hyaluronsäure – ein Basalpolysaccharid – wodurch die Ablösung der Sertoli-Zellen von der Basalmatrix eingeleitet und Keimzellen in die Lösung freigesetzt werden. DNase verdaut alle DNA-Verunreinigungen aus der Lösung und verhindert so die Zellaggregation.
Waschen Sie die enzymatisch verdauten Tubuli mit einem Puffer und entfernen Sie dabei Restenzyme, Zellfragmente und Keimzellen. Suspendieren Sie die verdauten Tubuli wieder und laden Sie die Suspension in eine Nadel-Spritzen-Anordnung.
Passieren Sie die Lösung wiederholt, um eine hydrodynamische Scherung zu erzeugen und die Tight Junctions der Sertoli-Zellen zu stören, indem sie als einzelne Zellen zusammen mit den verbleibenden Keimzellen freigesetzt werden.
Filtern Sie die Zellsuspension, entfernen Sie Zelltrümmer und erhalten Sie eine einzellige Suspension. Zentrifugieren Sie das Filtrat, um die Zellen zu pelletieren.
Resuspendieren Sie die Zellen in einem serumfreien Wachstumsmedium für die selektive Expansion der Sertoli-Zellen.
Um die Sertoli-Zellen zu isolieren, verwenden Sie eine neue 25-Milliliter-Pipette, um die abgesetzten Tubuli gründlich in 25 Millilitern PBS zu resuspendieren. Nachdem Sie die Tubuli weitere 12 Minuten einwirken gelassen haben, verwenden Sie dieselbe Pipette, um die Tubuli noch dreimal auf die gleiche Weise zu waschen. Übertragen Sie dann die Tubuli in eine neue 100-Milliliter-Flasche mit Schraubverschluss und fügen Sie die Hyaluronidase-DNase-I-Lösung hinzu. Verdauen Sie die Tubuli in einem Schüttelwasserbad bei 32 Grad Celsius für fünf Minuten.
Überprüfen Sie ein Aliquot der Suspension durch lichtmikroskopische Inspektion bei 100-facher Vergrößerung. Kurze Tubuli, röhrenförmige Aggregate und freigesetzte Zellen sollten sichtbar sein. Lassen Sie die röhrenförmigen Aggregate 10 Minuten lang absetzen. Verwenden Sie dann eine neue 25-Milliliter-Pipette, um den Überstand zu entfernen, und waschen Sie die Aggregate viermal in 25 ml PBS, mit einer Sedimentation von 10 Minuten zwischen jedem Waschgang.
Die kontaminierende PTC-Population wird reduziert worden sein. Geben Sie nach dem letzten Waschen 20 ml RPMI 1640 Medium in die Zellen und führen Sie die Suspension 10 Mal durch eine 18G-Nadel, die auf einer 20-Milliliter-Spritze montiert ist. Bestätigen Sie als Nächstes schnell, dass alle Aggregate dissoziiert wurden, und filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb, um eine reine Einzelzellsuspension zu erhalten.
Schleudern Sie das Filtrat herunter, indem Sie die 25-Milliliter-Pipette verwenden, um den Überstand vorsichtig abzusaugen. Anschließend resuspendieren Sie die isolierten Sertoli-Zellen in 40 ml serumfreiem RPMI 1640-Medium. Zählen Sie dann die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Trypanblau-Ausschluss und passen Sie die Zellkonzentration auf 3 x 106 Zellen pro Milliliter an. Zum Schluss füttern Sie 1 Milliliter Zellen pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Platte.