Selektive Isolierung von CD4^{+ Vδ1+} γδ T-Zellen aus mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes

γδ T-Zellen exprimieren T-Zell-Rezeptoren, TCRs, die aus Gamma- und Delta-Ketten mit variablen und konstanten Domänen bestehen.

CD4+ Vδ1+ T-Zellen – eine γδ T-Zell-Subpopulation – exprimieren die variable Vδ1-Kette und den CD4-Co-Rezeptor. Diese Zellen wandern in entzündetes Gewebe und transdifferenzieren sich in funktionell reife CD4+- oder CD8+-αβ-T-Zellen – und vermitteln so eine Immunantwort.

Um CD4+ Vδ1+ T-Zellen aus mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes, PBMCs, zu isolieren, resuspendieren Sie die Zellen in einem Puffer. Verwenden Sie ein Fc-blockierendes Reagenz, um die Fc-Rezeptoren auf der Zelloberfläche zu blockieren und eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Fügen Sie anti-Vδ1-Antikörper hinzu, die mit dem Fluorophor FITC konjugiert sind und an die Vδ1-Antigene der γδ-T-Zellen binden. Inkubieren Sie mit anti-FITC-Antikörper-gekoppelten magnetischen Mikrokügelchen, die an den FITC-Farbstoff auf den Vδ1 T-Zell-gebundenen Antikörpern binden

Das Gemisch wird durch eine magnetische Säule geleitet, um die kügelchengebundenen Vδ1+ T-Zellen anzuziehen; die Vδ1-T-Zellen bleiben ungebunden und werden anschließend ausgespült. Spülen Sie die Säule gewaltsam, indem Sie den Puffer durch sie schieben, um die Vδ1+ T-Zellen zu lösen.

Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-CD4-Antikörpern, die mit Antikörpern beschichtet sind und an den CD4-Co-Rezeptor der Zellen binden. Setzen Sie das Röhrchen in einen Magneten, um die perlengebundenen CD4+ Vδ1+ T-Zellen anzuziehen; die CD4- Vδ1+ T-Zellen bleiben ungebunden.

Resuspendieren Sie die CD4+ Vδ1+ T-Zellen in einem Medium. Fügen Sie ein Reagenz zum Ablösen von Kügelchen hinzu, um die Kügelchen aus den Zellen zu lösen. Setze das Rohr wieder auf den Magneten, um die Kügelchen zu trennen.

Entnehmen Sie den CD4+ Vδ1+ Zellüberstand für die weitere Analyse.

Bevor Sie mit der Isolierung von Vδ1-T-Zellen beginnen, verwenden Sie ein 1 x 10⁶ Aliquot des PBMC, um die Häufigkeit von Vδ1CD4-positiven T-Zellen in der Spenderprobe mittels Durchflusszytometrie zu bestimmen. Schleudern Sie dann den Rest der Lymphozyten herunter und suspendieren Sie das Pellet in 60 Mikrolitern MACS-Puffer pro 1 x 10⁷ Zellen.

Als nächstes werden die Zellen in 20 Mikrolitern Fc-blockierendem Reagenz pro 1 x 10⁷ Zellen blockiert, gefolgt von der Zugabe von 10 Mikrolitern FITC-konjugiertem anti-humanem Vδ1-Antikörper pro 1 x 10⁷ Zellen für 12 Minuten bei 4 Grad Celsius im Dunkeln. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen in 14 Millilitern MACS-Puffer.

Resuspendieren Sie das Pellet in 80 Mikrolitern MACS-Puffer pro 1 x 10⁷ Zellen und fügen Sie 20 Mikroliter Anti-FITC-Mikrokügelchen pro 1 x 10⁷ Zellen durch Mischen hinzu. Nach 15 Minuten im Dunkeln bei 4 Grad Celsius waschen Sie die Zellen in 10 Millilitern frischem MACS-Puffer

Während der Zentrifugation wird eine vorgekühlte magnetische Säule mit 500 Mikrolitern MACS-Puffer äquilibriert. Suspendieren Sie dann die Zellen in 500 Mikrolitern MACS-Puffer und geben Sie sie vorsichtig an den oberen Rand der Säule.

Spülen Sie die Säule mit drei 500-Mikroliter-MACS-Pufferwaschungen. Entfernen Sie dann die Säule vom Magneten und spülen Sie die Vδ1-positiven Zellen mit einem Kolben schnell mit 1 Milliliter MACS-Puffer in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Nachdem Sie die Zellen durch eine zweite Säule geführt haben, wirbeln Sie 25 Mikroliter CD4-Kügelchen 30 Sekunden lang vortexen. Übertragen Sie dann die Kügelchen in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen, das 1 Milliliter MACS-Puffer enthält, und setzen Sie das Röhrchen auf einen Magneten.

Nach 1 Minute wird der Überstand mit einer 200-Mikroliter-Pipette vorsichtig abgesaugt und die Kügelchen in 25 Mikrolitern MACS-Puffer resuspendiert. Als nächstes werden die isolierten Vδ1-positiven Zellen heruntergeschleudert und das Pellet in 500 Mikrolitern MACS-Puffer resuspendiert. Mischen Sie die Zellen kräftig mit den Kügelchen. Dann, nach 20 Minuten bei 4 Grad Celsius, bei ständigem Kippen, setzen Sie das Rohr wieder auf den Magneten.

Um einen Verlust des Probenvolumens zu vermeiden und das Vorhandensein kontaminierender CD4-negativer Zellen zu minimieren, ist es wichtig, den verbleibenden Puffer von der Innenseite des Deckels zurück in das Fläschchen zu pipettieren.

Nach zwei Minuten wird der CD4-negative Vδ1-positive Zellüberstand mit einer 200-Mikroliter-Pipette in ein frisches Röhrchen überführt. Entfernen Sie dann die CD4-positiven Zellen aus dem Magneten und resuspendieren Sie sie in 500 Mikrolitern MACS-Puffer.

Nachdem Sie die CD4-negativen Zellen zwei weitere Male entfernt haben, wie gerade gezeigt, inkubieren Sie die CD4-positiven Zellen in 100 Mikrolitern Kulturmedium und 10 Mikrolitern Lösung zum Ablösen von Kügelchen bei Raumtemperatur für 45 Minuten unter ständigem Kippen. Am Ende der Inkubation werden die Zellen für 1 Minute wieder in den Magneten eingesetzt und mit einer 200-Mikroliter-Pipette der Vδ1-positive CD4-positive Zellüberstand in ein neues Röhrchen überführt.

Nachdem Sie die verbleibenden Kügelchen zwei weitere Male entfernt haben, wie gerade gezeigt, schleudern Sie die Zellen herunter. Anschließend werden die Vδ1-positiven CD4-positiven Zellen zur Zählung in frischem, vorgewärmtem Medium resuspendiert.