Herstellung einer Antigen-Adjuvans-Emulsion zur Induktion der autoimmunen Enzephalomyelitis

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, EAE, ist eine Erkrankung des Zentralnervensystems. Autoantikörper zielen auf das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) in der Myelinscheide der Neuronen ab und verursachen eine Myelinzerstörung und Nervendegeneration.

Die EAE-Induktion bei Mäusen erfordert die Injektion einer Antigen-Adjuvans-Emulsion des Autoantigens MOG, gemischt mit einem Adjuvans, das ein bakterielles Antigen enthält, um die Immunantwort zu verstärken.

Zur Herstellung der Emulsion wird eine wässrige Suspension von MOG in ein Homogenisatorröhrchen gegeben. Legen Sie das Röhrchen auf Eis, um einen Antigenabbau zu verhindern.

Fügen Sie das Adjuvans hinzu – inaktivierte pathogene Bakterien, die in einer Ölphase dispergiert sind. Legen Sie das Röhrchen in einen Schüttelhomogenisator. Das Schütteln verursacht Turbulenzen in der Flüssigkeit, wodurch eine Emulsion entsteht.

Unter dem Mikroskop zeigt die Emulsion gleichmäßig dispergierte, mikrokleine, wässrige Tröpfchen – die MOG enthalten – innerhalb einer kontinuierlichen Ölphase. Die Homogenität der Emulsion sorgt für eine höhere Reproduzierbarkeit der Krankheitsinduktion.

Um die Emulsion in einen anfälligen Mäusestamm zu injizieren, befestigen Sie eine Spritze an der Vorderseite des Röhrchens und übertragen Sie die Emulsion hinein. Nehmen Sie eine betäubte Maus und injizieren Sie die Emulsion subkutan.

Nach der Injektion sorgt das Öl in der Emulsion für eine langsame und anhaltende Antigenfreisetzung, wodurch die Dauer der Immunantwort verlängert wird.

Der inaktivierte Erreger in der Emulsion verursacht eine lokalisierte Entzündungsreaktion, die Immunzellen an die Injektionsstelle rekrutiert. Die rekrutierten Immunzellen erkennen das freigesetzte MOG-Antigen und stimulieren die Antikörperproduktion, was zur Induktion von EAE führt.

Legen Sie das Schraubröhrchen in Reagenzien, die auf Eis verwendet werden sollen. Fügen Sie als Nächstes die Emulsionskomponenten hinzu. Zuerst PBS, dann das Peptid, die CFA-Aufschlämmung und schließlich IFA. Verschließen Sie die Tube mit der Kappe fest, indem Sie sie mehrmals festziehen und lösen. Schütteln Sie das Röhrchen 5 bis 10 Sekunden lang kräftig mit der Hand, um die Reagenzien vorzumischen.

Legen Sie das Röhrchen in den Schüttelhomogenisator und befestigen Sie es mit der Stange. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf die höchste Stufe und die Zeit auf 60 Sekunden ein. Sobald der Lauf beendet ist, lege die Röhre für 3 Minuten auf Eis und wiederhole den Lauf noch 1 oder 2 Mal mit den gleichen Einstellungen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 1 Minute, um eingeschlossene Luft zu entfernen und die Emulsion zu verdichten. Entfernen Sie die Kappe von der Tube, setzen Sie den Kolben in die Tube ein und drücken Sie ihn langsam nach unten, bis er die Oberseite der Emulsion erreicht. Entfernen Sie das Abbrechgehäuse an der Unterseite des Rohres, indem Sie es drehen.

Entfernen Sie als Nächstes den Kolben von allen Injektionsspritzen und fügen Sie den Injektionsspritzen eine Nadel hinzu. Befestigen Sie dann das hintere Ende der Injektionsspritze an der speziellen Verriegelung an der Unterseite des Schlauchs und verriegeln Sie sie mit einer kurzen Drehung. Übertragen Sie die Emulsion vom Schlauch auf die Injektionsspritze, indem Sie den Kolben leicht drücken.

Stoppen Sie, wenn die Emulsion die 0,15-Milliliter-Teilung der Injektionsspritze erreicht. Trennen Sie die Injektionsspritze vom Schlauch und setzen Sie den Kolben vorsichtig ein, wobei Sie darauf achten müssen, dass keine Luft in die Spritze eindringt. Schieben Sie den Kolben, bis die Emulsion aus der Nadel austritt, und wiederholen Sie den Vorgang für den Rest der in der Tube vorhandenen Emulsion

Um die Größe der Wasser-in-Öl-Partikel zu analysieren, geben Sie einen winzigen Tropfen der Emulsion auf einen Objektträger, schmieren Sie ihn mit einem Deckglas ab und drücken Sie dann in kreisenden Bewegungen fest, um die Emulsion abzuflachen.

Untersuchen Sie die verschmierte Emulsion unter einem Phasenkontrastmikroskop mit 400-facher Vergrößerung und fokussieren Sie sich auf ein Feld mit einer Monoschicht der Emulsion. Stellen Sie sicher, dass kleine, gleichmäßige graue oder weiße Partikel sichtbar sind.