Intravitale Visualisierung von intraepithelialen Gamma-Delta-Lymphozyten

Intraepitheliale Gamma-Delta-Lymphozyten, γδ-IELs, sind spezialisierte wandernde T-Zellen, die Gamma-Delta-T-Zell-Rezeptoren exprimieren. Diese Zellen befinden sich überwiegend im Darmepithel und patrouillieren im Epithel, um die Translokation von Krankheitserregern durch den Darm zu begrenzen.

Um γδ-IELs in einem lebenden Organismus sichtbar zu machen, beginnen Sie mit einer anästhesierten transgenen Maus mit einem teilweise exponierten Dünndarm. Die transgene Maus ist genetisch so verändert, dass sie Reporterproteine – verstärkte grün fluoreszierende Proteine – ausschließlich in γδ-IELs exprimiert, was deren Verfolgung ermöglicht.

Legen Sie mit einem Elektrokauter eine Perforationslinie über dem freiliegenden Dünndarm entlang der antimesenterialen Oberfläche an, um übermäßige Blutungen zu verhindern.

Machen Sie einen Längsschnitt über die Perforationslinie, um die Darmschleimhaut freizulegen, die mehrere fingerartige Vorsprünge – Zotten – zeigt. Jede Zotte enthält Epithelzellen mit residierenden γδ IELs, die in das Darmlumen hineinragen.

Positionieren Sie die Maus mit der freiliegenden Schleimhautoberfläche direkt in Kontakt mit dem Fluoreszenzfarbstoff, wodurch dem Lumen rote Fluoreszenz zugeführt wird.

Stellen Sie sich die Maus unter einem konfokalen Mikroskop vor. Lokalisieren Sie einen Zotten und ein Bild in verschiedenen Fokusebenen entlang der z-Achse, beginnend mit dem Epithel der Zottenspitze. Kombinieren Sie diese optischen Schnitte, um ein 3D-Bild zu erzeugen.

Die Intravitalbildgebung zeigt die dynamische Bewegung von grün fluoreszierenden γδ IELs entlang der Basalmembran der Epithelzelle in der Nähe des roten Lumens.

Platzieren Sie zwei Pinzettenpaare auf beiden Seiten des darunter liegenden Mesenteriums zwischen den Blutgefäßen und reiben Sie die Spitzen der Pinzette vorsichtig aneinander, um ein Loch in der Membran zu erzeugen. Dringen Sie mit einer abgewinkelten Pinzette und einer gebogenen Nadel mit konischer Spitze, die an einer 5-Zentimeter-Naht befestigt ist, durch das Loch in der Membran und nach oben durch die andere Seite der Peritonealschleimhaut ein, wobei Sie eine Naht oben und eine andere in der Nähe der Unterseite des Einschnitts platzieren, um den Einschnitt zu schließen, während die Darmschlaufe nach außen gedrückt bleibt.

Um die Erfolgswahrscheinlichkeit zu erhöhen, sollten Sie beim Platzieren der Bauchstruktur keine Blutgefäße abbinden oder einreißen und den Fremdeingriff auf den Darm einschränken.

Schließen Sie dann die Haut unter der Darmschlinge auf die gleiche Weise und platzieren Sie eine Naht in der Mitte des Schnitts zwischen den vorherigen Nähten im darunter liegenden Bauchfell. Machen Sie mit einem Elektrokauter eine Perforationslinie entlang des antimesenterialen Randes und tragen Sie sofort einige Tropfen Wasser auf die Darmoberfläche auf, um zusätzliche hitzeinduzierte Gewebeschäden zu vermeiden.

Mit einem Kimwipe abtupfen, um Restwasser zu entfernen. Schneiden Sie mit einer Vannas-Schere einen etwa 1,5 Zentimeter großen horizontalen Schlitz am distalen Rand des kauterisierten Gewebes entlang der Länge der kauterisierten Linie in Richtung des proximalen Endes des externalisierten Gewebesegments. Wenn die Schleimhautoberfläche freiliegt, bedecken Sie den Bauch mit einem feuchten Kimwipe, um das Gewebe mit Feuchtigkeit zu versorgen.

Transportieren Sie die Maus für die konfokale Mikroskopie mit rotierenden Scheiben in einem abgedeckten Gefäß zum Mikroskop. Starten Sie die Bildgebungssoftware, neigen Sie den Kopf des Mikroskops nach hinten und geben Sie 150 Mikroliter 1 mikromolaren Flotten-AlexaFluor-Farbstoff in Hanks gepufferter Kochsalzlösung auf den mit der Glasabdeckung verrutschten Boden. Positionieren Sie die Maus so, dass die geöffnete Schleimhautoberfläche direkt mit dem Deckglas in Kontakt kommt.

Legen Sie die Maus und die Schale in einen vorgewärmten Inkubator auf den Bildgebungstisch. Stellen Sie die Anregungsintensität und die Belichtungszeit für jeden Laser auf nicht mehr als 10 bis 15 Milliwatt bzw. 120 bis 150 Millisekunden ein und stellen Sie den Bilddurchschnitt auf "2" ein.

Aktivieren Sie die Verstärkungsfunktion zur Elektronenvermehrung, um das Hintergrundrauschen zu reduzieren, und wählen Sie die 63X-Objektivkalibrierung aus, um eine korrekte Messung der Pixelgröße zu gewährleisten. Mit dem 405-Nanometer-Laser und dem 20-fach-Luftobjektiv können Sie die Zellkerne manuell visualisieren, um ein Feld von Zotten zu lokalisieren, die keine spürbare Bewegung oder Drift aufweisen, und vermeiden Sie Bereiche mit künstlicher Bewegung aufgrund von Atmung, Peristaltik oder Herzschlag.

Nehmen Sie mit dem XY-Scan die x-y-Koordinate des interessierenden Feldes auf und wechseln Sie zum Glycerin-Immersions-63X-Objektiv. Nehmen Sie bis zu 1 Minute lang ein Live-Bild auf dem 405-Nanometer-Kanal auf, um zu bestätigen, dass die Zotten im ausgewählten Feld stabil sind, während Sie den Fokus so anpassen, dass die orthogonale Ebene direkt unter der Zottenspitze gefunden wird.

Nehmen Sie dann Z-Stapel auf, beginnend knapp unterhalb des Epithels der Zottenspitze, etwa 15 bis 20 Mikrometer, bis hinunter zu den Zotten, bis es schwierig ist, die Zellkerne in 1,5-Mikrometer-Schritten aufzulösen. 3 bis 5 Minuten nach Beginn der Aufnahme bestätigen Sie die Bildstabilität und die Gamma-Delta-Motilität der intraepithelialen Zellen und setzen Sie die Bildaufnahme für jedes Zottenfeld 30 bis 60 Minuten lang fort.