Eine in vitro Technik zur Unterscheidung von GM-CSF-produzierenden T-Helferzellen von naiven T-Zellen

GM-CSF ist ein Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor und wird von GM-CSF-produzierenden T-Helfer- oder T_HGM-Zellen sezerniert. Diese Zellen zeigen eine geringe Expression anderer T-Helferzell-spezifischer Zytokine.

In-vitro-Differenzierung von TH-GM-Zellen zu beginnen, nehmen Sie eine T-Helferzellsuspension - isoliert aus der Milz der Maus - die antigenaktivierte reife Zellen und undifferenzierte naive Zellen enthält.

Fügen Sie fluoreszenzmarkierte Antikörper hinzu, die auf charakteristische Oberflächenmarker der naiven und reifen Zellen abzielen. Führen Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung durch, um die naiven T-Zellen zu isolieren.

Plattieren Sie die Zellen in einem gut beschichteten Behälter, der mit Antikörpern beschichtet ist, die an den T-Zell-Rezeptorkomplex binden. Fügen Sie einen Antikörper hinzu, der an den co-stimulatorischen Rezeptor bindet. Durch die synergistische Bindung werden die Zellen aktiviert.

Fügen Sie Interleukin 7 - ein Zytokin - hinzu, das die Differenzierung in T_HGM-Zellen und die GM-CSF-Produktion induziert. Fügen Sie Phorbolmyristatacetat, PMA – eine entzündungsfördernde Verbindung, Ionomycin – ein Calciumionophor und einen Proteintransporthemmer hinzu.

PMA dringt in die Zelle ein und aktiviert eine Proteinkinase. Das membrandurchlässige Ionomycin transloziert die Kalziumionen in der Zelle – und erhöht so die intrazelluläre Kalziumkonzentration.

Die Aktivierung der Proteinkinase und ein hoher Kalziumspiegel initiieren Signale, die dieDH-GM-Zellen restimulieren – was zu einer höheren GM-CSF-Produktion führt. Der Proteintransportinhibitor blockiert die GM-CSF-Sekretion und unterstützt so den intrazellulären Nachweis.

Führen Sie Immunfluoreszenzfärbungen durch, weisen Sie intrazelluläre Zytokine nach und analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Die Mehrzahl der Zellen, die hohe GM-CSF-Spiegel, aber eine geringe Expression anderer Zytokine aufweisen, deutet auf eine erfolgreiche Differenzierung in T_HGM-Zellen hin.

Um die CD4-positiven T-Zellen zu isolieren, resuspendieren Sie das Pellet der weißen Blutkörperchen in 5 Millilitern Zellisolationspuffer und filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 30-Mikrometer-Sieb in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen, um alle Ablagerungen zu entfernen. Nach der Zählung resuspendieren Sie die Zellen bei einer Pufferkonzentration von 1 x 10⁷ Zellen pro 90 Mikroliter und fügen Sie 10 Mikroliter anti-CD4-konjugierte magnetische Kügelchen pro 1 x 10⁷ Zellen für eine 15-minütige Inkubation bei 4 Grad Celsius hinzu, wobei alle 5 Minuten gemischt wird.

Während die Zellen inkubieren, stellen Sie eine Trennsäule auf einen Magnetständer und befeuchten Sie die Säule mit 2 Millilitern Puffer. Waschen Sie dann die Zellen mit 5 Millilitern Puffer und resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter Puffer. Laden Sie die Probe auf die Säule und sammeln Sie die CD4-negative Fraktion in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen.

Wenn alle Zellen die Säule durchlaufen haben, waschen Sie das Reservoir dreimal mit 1 Milliliter Puffer pro Waschgang, bevor es trocknet. Übertragen Sie die Säule nach dem letzten Waschen in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen und tauchen Sie die Säule mit 2 Millilitern Zellisolationspuffer ein, um die positive Bead-Fraktion auszustoßen. Sammeln Sie dann die CD4-positiven Zellen durch Zentrifugation.

Für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung der naiven T-Zellen resuspendieren Sie das bead-sortierte CD4-positive Zellpellet in 500 Mikrolitern Puffer und mischen Sie die Zellen mit einem geeigneten fluoreszenzkonjugierten Antikörpercocktail. Nach 20 bis 30 Minuten auf Eis unter Lichtschutz die Zellen in 5 Millilitern frischem Puffer waschen und das Pellet in 500 Mikrolitern frischem Puffer resuspendieren.

Filtern Sie die Zellen durch ein Nylonnetz und geben Sie die Zellen in ein FACS-Röhrchen, das mit 500 Mikrolitern Puffer vorcodiert ist. Gate zur Auswahl der CD4-positiven, CD25-negativen und CD44-niedrigen CD62-Liganden mit hohen Zellpopulationen. Sortieren Sie dann die naiven CD4-positiven, CD25-negativen, CD-44-niedrigen und CD-62-Liganden hohen T-Zellfraktionen in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und pelletieren Sie die isolierten naiven CD4-positiven T-Zellen durch Zentrifugation.

Für die Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor oder GM-CSF, T-Helferzell-Differenzierung, resuspendieren Sie die sortierten T-Zellen in einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen pro Milliliter in vollständigem RPMI-Medium, das 50 mikromolare Beta-Mercaptoethanol enthält, und aspirieren Sie den Anti-CD3-Epsilon-Antikörper aus jeder Vertiefung einer vorkodierten 48-Well-Platte.

Säen Sie dann 2,5 x 10⁵ Zellen zusammen mit IL-7, Anti-CD28 und Anti-IFN-Gamma in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO₂. Verwenden Sie am dritten Tag der Kultur ein Mikroskop, um die Zelldifferenzierung zu überprüfen, und ernten Sie die Zellen für die Zentrifugation.

Resuspendieren Sie das Pellet zwei Mal lang in frischem vollständigem RPMI-Medium und resuspendieren Sie die Zellen nach dem zweiten Waschen zur Zählung in 1 Milliliter frischem vollständigem Medium. Teilen Sie die Zellen in drei gleiche Volumina auf und stimulieren Sie das erste Aliquot der Zellen mit PMA und Ionomycin in Gegenwart eines Proteintransporthemmers für 4 bis 6 Stunden.

Am Ende der Stimulation ernten Sie die Zellen für die Färbung mit Anti-CD4-Antikörpern. Nach 30 Minuten fixieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern Fixierungspuffer für 20 bis 60 Minuten, gefolgt von zwei Waschgängen in 1 Milliliter Permeabilisierungspuffer pro Waschgang. Färben Sie dann 30 Minuten lang im Dunkeln auf intrazelluläre Zytokinexpression.