Identifizierung von Kinase-Inhibitoren, die die Reaktion der Thymozyten auf starke TCR-Signale modulieren

Beginnen Sie mit Thymozytenzellen von Mäusen in einer Multi-Well-Platte. Fügen Sie magnetische Kügelchen hinzu, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet sind. Zu einer Teilmenge von Vertiefungen wird eine geeignete Konzentration des Testkinase-Inhibitors hinzugefügt. Ausbrüten.

Die Antikörper binden an die CD3- und CD28-Rezeptoren der Zelloberfläche auf den doppelt-positiven Thymozyten und aktivieren diese, was zu einer Herunterregulierung der T-Zell-Rezeptoren, TCRs und einer Aktivierung der zytosolischen Proteinkinase führt.

Diese Proteinkinasen aktivieren nachgeschaltete Signalwege, was zu einer erhöhten CD69-Expression auf der Zelloberfläche und einer zytosolischen Caspase-3-Aktivierung führt. Aktivierte Caspase-3 spaltet essentielle zelluläre Proteine und leitet so die Apoptose der Thymozyten ein.

In Zellen, die mit dem Kinase-Inhibitor behandelt wurden, blockieren die Inhibitoren die zytosolischen Kinasen und modulieren die CD69-Expression und die Caspase-3-Aktivierung.

Pipettieren Sie einen mit Fluorophoren markierten Antikörpercocktail ein, der an die TCR-, CD4- und CD8-Co-Rezeptoren sowie CD69-Rezeptoren der Thymozyten bindet. Behandeln Sie die Thymozyten mit einem Puffer, um sie zu fixieren und zu permeabilisieren.

Inkubieren Sie mit einem Fluorophor-markierten Anti-Caspase-3-Antikörper, der an zytosolische Caspase-3 bindet. Analysieren Sie die Thymozyten mittels Durchflusszytometrie.

Doppel-positive Kontrollthymozyten exprimieren die fluoreszierenden Zelloberflächenmarker CD4, CD8 und CD69 sowie intrazelluläre Caspase-3 und zeigen eine TCR-Herunterregulierung. Im Gegensatz dazu weisen mit Inhibitoren behandelte Thymozyten niedrigere Konzentrationen von fluoreszierendem CD69 und Caspase-3 auf.

Um die Behandlung von Thymozyten mit Kinase-Inhibitoren zu beginnen, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 40 Mikroliter Thymozyten pro Vertiefung auf eine Platte mit kleinem Volumen zu geben. Den Teller auf Eis legen. Pipettieren Sie dann einen Teil der Kinase-Inhibitoren, DMSO und Dexamethason und vier Teile des gesamten RPMI-Mediums in eine 96-Well-Platte.

Bestimmen Sie acht Vertiefungen der kleinvolumigen Platte für unbehandelte Kontrollen, vier Vertiefungen für mit Dexamethason behandelte Positivkontrollen für den Zelltod, indem Sie das verdünnte Dexamethason in der 5-mikromolaren Konzentration hinzufügen, und vier Vertiefungen für Vehikel-behandelte Kontrollen, indem Sie 0,5 Mikroliter des verdünnten DMSO hinzufügen. Geben Sie anschließend aus den entsprechenden Vertiefungen der Inhibitorplatte 0,5 Mikroliter jedes verdünnten Inhibitors in die 96-Well-Platte.

Um mit der Stimulation der Thymozyten zu beginnen, stellen Sie zunächst sicher, dass die Anti-CD3- und CD28-Kügelchen gleichmäßig resuspendiert sind. Als nächstes waschen Sie 1 Milliliter der Kügelchen mit 2 Millilitern PBS-Puffer. Legen Sie das Röhrchen auf einen magnetischen Ständer, um die Kügelchen vom Überstand zu trennen, und saugen Sie die Lösung ab. Suspendieren Sie dann die Kügelchen in 1 Milliliter des vollständigen RPMI-Mediums.

Geben Sie 10 Mikroliter der Bead-Suspension pro Vertiefung zu jeder mit Inhibitor behandelten Probe, den vier DMSO-behandelten Proben und vier der 8 unbehandelten Proben. Geben Sie 10 Mikroliter des kompletten RPMI in die verbleibenden vier unbehandelten Vertiefungen.

Verwenden Sie einen Mikrotiterplatten-Orbitalschüttler, um die Platte vorsichtig zu bewegen. Inkubieren Sie anschließend die Thymozyten 17 bis 20 Stunden lang oder über Nacht in einer Umgebung von 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Grundieren Sie einen automatisierten Laminar-Flow-Plattenwascher zunächst mit 150 Millilitern Ethanol-Tween-Lösung, dann mit entionisiertem Wasser, das mit 1 % Tween-20 ergänzt wird, und schließlich mit FACS-Waschpuffer. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Platte mit dem Plattenwaschsystem mit FACS-Waschpuffer in einem neunmaligen Waschgang. Bei jedem Waschgang werden 55 Mikroliter Waschpuffer durch laminare Strömung hinzugefügt und entfernt, was zu einer exponentiellen Verdünnung der Reagenzien in den Wells führt.

Um Oberflächenantigene zu färben, verdünnen Sie zunächst eine Volumeneinheit Anti-CD3-, Anti-CD4-, Anti-CD8- und Anti-CD69-Antikörper in 100 Volumeneinheiten des FACS-Waschpuffers. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 25 Mikrolitern der färbenden Antikörpermischung. Verwende einen Mikrotiterplatten-Orbitalschüttler, um die Platte vorsichtig zu bewegen, und lasse die Platte dann 30 Minuten lang auf Eis.

Um die Zellen zu fixieren, waschen Sie die Platte zunächst mit 55 Mikrolitern FACS-Waschpuffer im neunmaligen Waschgang wie zuvor beschrieben. Geben Sie dann 50 Mikroliter des Fixierungs- und Permeabilisierungspuffers in jede Vertiefung. Gut mischen und den Teller 30 Minuten auf Eis inkubieren. Bereiten Sie nach der Inkubation einen 1x Dauerwellen-/Waschpuffer vor, indem Sie 25 Milliliter der bereitgestellten 10x Brühe in 225 Milliliter Reinstwasser verdünnen.

Grundieren Sie die Tellerwaschmaschine mit 1x Puffer und waschen Sie die Platte mit 55 Mikrolitern des 1x Puffers in einem neunmaligen Waschgang wie zuvor beschrieben. Mischen Sie 1 Milliliter des Anti-Caspase-3-Antikörpers mit 2 Millilitern der 1x Perm und waschen Sie den Puffer. Geben Sie 25 Mikroliter pro Vertiefung der Mischung zu den fixierten Zellen.

Verwenden Sie einen Mikrotiterplatten-Orbitalschüttler, um die Platte vorsichtig zu bewegen. Lassen Sie den Teller eine Stunde lang auf Eis. Wiederholen Sie am Ende der Inkubation den Waschschritt neunmal mit der 1x Dauerwelle und dem Waschpuffer. Geben Sie dann 25 Mikroliter des FACS-Waschpuffers in alle Vertiefungen der Platte, pipettieren Sie einige Male auf und ab, um die Lösung zu mischen.

Zum Schluss werden die gemischten Proben in Mikrotiterröhrchen überführt. Füllen Sie die Röhrchen mit dem FACS-Waschpuffer auf ein Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern auf und fahren Sie mit der durchflusszytometrischen Analyse fort.