Aktivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark der Maus als Reaktion auf Antikörper

Nach der Exposition gegenüber Krankheitserregern werden Makrophagen aktiviert und setzen entzündungsfördernde und entzündungshemmende Zytokine frei, die die Reaktion des Immunsystems koordinieren.

Um die Aktivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark in vitro zu untersuchen, überführen Sie eine isolierte Suspension von Knochenmarkzellsuspensionen der Maus in einen Kulturkolben. Kurz inkubieren.

Die mesenchymalen Zellen, Monozyten und reifen Makrophagen haften an der Kolbenoberfläche, während die hämatopoetischen Vorläuferzellen in Suspension bleiben.

Sammeln Sie das Medium, das hämatopoetische Vorläuferzellen und Zentrifuge enthält. Übertragen Sie die in Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor, M-CSF, resuspendierten Zellen in einen Kulturkolben.

M-CSF bewirkt, dass sich die myeloische Vorläufer-Subpopulation in Makrophagen differenziert, die verzweigt erscheinen und am Kolben haften.

Entsorgen Sie das nicht adhärente zellhaltige Medium. Fügen Sie M-CSF-Medien hinzu, und inkubieren Sie. Sobald die Makrophagen ihren voll funktionsfähigen Zustand erreicht haben, ernten Sie sie. Zentrifuge.

Plattenmakrophagen, die in M-CSF-Medien in Multi-Well-Plattenvertiefungen resuspendiert werden. Nach dem Adhärieren der Makrophagen an den Vertiefungen fügen Sie humane polyklonale Immunglobuline und das bakterielle Lipopolysaccharid, LPS, ein Toxin, hinzu.

Immunglobuline binden an spezifische FCγ-Rezeptoren, während LPS an Toll-like-Rezeptoren auf Makrophagen bindet. Diese Co-Stimulation treibt die Aktivierung der entzündungshemmenden Makrophagen über nachgeschaltete Signalkaskaden voran und bewirkt die Freisetzung hoher Spiegel an entzündungshemmenden Zytokinen und niedriger Spiegel an proinflammatorischen Zytokinen.

Sammeln Sie das zytokinhaltige Medium für die weitere Analyse, um die Makrophagenaktivierung zu bestätigen.

Befestigen Sie eine euthanasierte Maus in Rückenlage mit ausgestreckten Gliedmaßen auf einer Schaumstoffplatte und reinigen Sie dann die Beine mit 70 % Ethanol. Machen Sie als Nächstes einen flachen Schnitt von etwa 2 Millimetern Tiefe, um die Haut und das Fell von der Oberfläche jedes Hinterbeins zu entfernen. Präparieren Sie dann das Gewebe, um Zugang zu den Tibias und Femuren zu erhalten.

Um die Tibias und Femurs zu entfernen, schneiden Sie den Knochen und die Muskeln direkt unterhalb des Hüftgelenks und oberhalb der Knöchel ab. Entfernen Sie dann so viel Muskelgewebe wie möglich von den Knochen. Reinigen Sie anschließend die Knochen mit 70% Ethanol und lassen Sie es 1 Minute lang verdampfen, dann legen Sie die Knochen in eine 6-Well-Platte, die mit Bone Flush Medium gefüllt ist.

Schneiden Sie in der Platte 1 Millimeter von beiden Enden der Oberschenkelknochen ab, so dass die inneren Hohlräume freiliegen. Stellen Sie sicher, dass eine 26-Gauge-Nadel an die Kavitäten herankommt. Trennen Sie anschließend das Schienbein und den Oberschenkelknochen vom Kniegelenk. Führen Sie dann die Nadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, in eine Knochenhöhle ein und entnehmen Sie das Knochenmark.

Fassen Sie das Knochenmark von allen 4 Knochen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 5 Millilitern Knochenspülmedium. Pipettieren Sie das Medium und das Mark mehrmals auf und ab oder wirbeln Sie mit langsamer Geschwindigkeit, um die Klumpen in der Suspension sanft zu verteilen. Markfäden sollten in kleine Markflecken von weniger als einem halben Millimeter Länge zerlegt werden.

Füllen Sie dann das Röhrchen auf 50 Milliliter mit Knochenspülmedium auf und geben Sie es in einen 75 Quadratzentimeter großen Gewebekulturkolben. Inkubieren Sie das Knochenmark eine Stunde lang. Während der Inkubation haften die gereiften Zellen an dem Kolben und die gewünschten hämatopoetischen Vorläuferzellen bleiben in Suspension. Übertragen Sie die Suspension in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die Zellen zu einem Pellet herunter.

Entsorgen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 Millilitern MCSF-Kulturmedium. Stellen Sie dann die Zelldichte auf 500.000 pro Milliliter ein und laden Sie 30 Milliliter in einen neuen 75-Quadratzentimeter-Kolben. Fahren Sie mit der Kultivierung der Zellen fort und überprüfen Sie an den Tagen 4, 7 und 10, ob die Zellen adhärent und leicht verzweigt sind, indem Sie ein invertiertes Phasenkontrast-Hellfeldmikroskop verwenden.

Entsorgen Sie bei der Überprüfung der Zellen das Medium, das die nicht adhärenten Zellen enthält. Waschen Sie dann die adhärenten Zellen einmal mit IMDM und geben Sie 30 Milliliter frisches MSCF-Kulturmedium zurück in den Kolben. Ersetzen Sie das Medium an Tag 10 durch 8 Milliliter enzymfreien Zelldissoziationspuffer auf EDTA-Basis, um die Zellen zu sammeln. Inkubieren Sie die Zellen kurz, kratzen Sie die Zellen vorsichtig ab und überprüfen Sie mit einem Mikroskop, ob sie freigesetzt wurden.

Sobald die Zellen freigesetzt sind, wird der Puffer mit den Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt, dann wird der Kolben dreimal mit 5 Millilitern IMDM gespült, um weitere Zellen zu sammeln. Bündeln Sie alle Sammlungen, zentrifugieren Sie sie und resuspendieren Sie das Pellet in 3 Millilitern MCSF. Zählen Sie nun die Zellen und stellen Sie ihre Konzentration auf 1 Million pro Milliliter ein.

Plattieren Sie dann 100 Mikroliter Zellsuspension pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. Die gesamte Platte sollte befüllbar sein. Kultivieren Sie die Zellen etwa eine Stunde lang, bis sie adhärent sind. Stimulieren Sie sie dann mit unterschiedlichen Konzentrationen von LPS oder intravenösem Immunglobulin oder beidem, das in IMDM hergestellt wurde. Führen Sie alle Manipulationen in doppelter oder dreifacher Ausführung durch und stellen Sie sicher, dass unbehandelte Kontrollen aufbewahrt werden, inkubieren Sie die Zellen dann 24 Stunden lang und analysieren Sie die Überstände.