In vivo Aktivierung von Peritonealmakrophagen als Reaktion auf Antikörper in einem Mausmodell

Peritoneale Makrophagen, die sich in der Bauchhöhle befinden, verschlingen Krankheitserreger und sezernieren entzündungsfördernde und entzündungshemmende Zytokine, um die Immunantwort zu modulieren.

Um die In-vivo-Aktivierung von Peritonealmakrophagen zu untersuchen, beginnen Sie damit, die Maus zurückzuhalten, um ihre Bewegung zu minimieren. Nehmen Sie eine Mischung aus Lipopolysacchariden – von Krankheitserregern abgeleiteten Antigenen und intravenösen Immunglobulinen – und injizieren Sie sie intraperitoneal.

Nach der Injektion binden Lipopolysaccharide an die Mustererkennungsrezeptoren der Makrophagen, lösen eine Immunantwort aus und setzen entzündungsfördernde Zytokine, einschließlich IL-12, frei.

Im Gegensatz dazu interagieren Immunglobuline mit Makrophagen-Fc-Rezeptoren und regulieren die Immunantwort herunter, indem sie die IL-12-Produktion unterdrücken und die Freisetzung von entzündungshemmenden Zytokinen, einschließlich IL-10, fördern. Diese Co-Stimulation durch Lipopolysaccharide und Immunglobuline aktiviert Peritonealmakrophagen zu entzündungshemmenden Makrophagen.

Sichern Sie die eingeschläferte Maus und machen Sie einen Längsschnitt entlang der Bauchhöhle. Ziehen Sie die Haut vom Bauchmuskel zurück. Injizieren Sie einen Puffer in die Bauchhöhle; Rühren, um Zellen aus der Bauchhöhle zu entfernen.

Sammeln Sie die aktivierte Makrophagen-haltige Bauchfellflüssigkeit.

Kultivieren Sie diese aktivierten Makrophagen in einem Medium, das co-stimulierende Moleküle – Immunglobuline und Lipopolysaccharide – enthält, um die Zytokinproduktion zu ermöglichen. Sammeln Sie das verbrauchte Medium und quantifizieren Sie die Zytokinspiegel mit einem enzymgebundenen Immunsorbent-Assay.

Eine höhere IL-10-Konzentration als IL-12 bestätigt eine erfolgreiche Aktivierung der peritonealen entzündungshemmenden Makrophagen.

Bereiten Sie eine 1-Milliliter-Spritze mit der erforderlichen Menge an intravenösem Immunglobulin und LPS vor und setzen Sie eine 26-Gauge-Nadel ein. Verwenden Sie für Steuerelemente stattdessen PBS plus LPS.

Fassen Sie die Maus am Genick und sichern Sie mit einer Hand die Hinterhand und den Schwanz. Zielen Sie auf den unteren rechten Quadranten des Bauches und führen Sie die Nadel in einem Winkel von 30 bis 40 Grad mit der Abschrägung nach oben ein und führen Sie sie etwa 1,5 cm ein. Injizieren Sie dann den Bolus. Ernten Sie nach einer Stunde Peritonealmakrophagen, nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben.

Stecken Sie die euthanasierte Maus in einer sterilen Haube mit ausgebreiteten Gliedmaßen auf eine Schaumstoffplatte und sterilisieren Sie den Bauch mit 70 % Ethanol. Machen Sie dann einen flachen 2-Millimeter-Schnitt entlang der Mittellinie und ziehen Sie die Bauchhaut ab. Vermeiden Sie es, die Peritonealwand zu punktieren.

Laden Sie anschließend eine 5-Milliliter-Spritze vollständig mit sterilem PBS bei einem pH-Wert von 7,4 und injizieren Sie die Maus mit einer 25- oder 27-Gauge-Nadel am oberen Rand der Bauchhöhle von beiden Seiten zur Mittellinie mit der Abschrägung der Nadel nach oben. Nachdem Sie die Nadel herausgezogen haben, massieren Sie das Bauchfell 10 Sekunden lang, um die Zellen zu lösen.

Führen Sie nun die Nadel wieder in den Hohlraum ein und sammeln Sie etwa 3,75 Milliliter Spülflüssigkeit. Füllen Sie die Spülflüssigkeit in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Wiederholen Sie die Injektion, Massage und Sammlung der Spülflüssigkeit noch drei weitere Male und bündeln Sie alle Sammlungen in derselben Tube.

Bei der endgültigen Entnahme kann es einfacher sein, die Spülflüssigkeit von der anderen Seite der Maus zu entfernen. Als nächstes schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren sie in 500 Mikrolitern Beschichtungsmedium. Zählen Sie dann die lebensfähigen Makrophagen und resuspendieren Sie sie bei 1 Million pro Milliliter. Füllen Sie nun 100 Mikroliter Suspension in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. Inkubieren Sie die Zellen anschließend eine Stunde lang.

Die Peritonealmakrophagen haften an der Platte. Entfernen Sie dann die nicht anhaftenden Zellen und spülen Sie jede Vertiefung zweimal mit 200 Mikrolitern warmem IMDM aus. Warten Sie nach jedem Waschen 10 Sekunden und kippen Sie die Platte langsam, um die Spüllösung zu sammeln. Geben Sie nach den Wäschen wieder 100 Mikroliter Beschichtungsmedium hinzu und stellen Sie die Platte in den Inkubator.

Für den ELISA inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang ohne Stimulation. Sammeln und klären Sie dann das konditionierte Medium für die Zytokinanalyse.