Evaluierung der impfstoffinduzierten Immunität gegen bakterielle Infektionen im Mausmodell

Um die impfstoffinduzierte Immunität zu untersuchen, nehmen Sie eine Injektion, die mit einem azellulären Pertussis-Impfstoff gefüllt ist. Der Impfstoff enthält antigene Proteine eines Bakteriums, das Atemwegserkrankungen verursacht – Bordetella pertussis – und Adjuvantien, die die Antigenexposition für eine anhaltende Immunantwort verlängern.

Injizieren Sie den Impfstoff intramuskulär in eine anästhesierte Maus.

Nach der Injektion fangen die residenten antigenpräsentierenden Zellen, APCs, die antigenen Proteine ein, verarbeiten sie zu Peptiden und präsentieren sie auf ihrer Oberfläche. Diese APCs wandern dann zu nahegelegenen Lymphknoten und interagieren mit T-Zellen, wodurch deren Aktivierung und Differenzierung zu Effektor-T-Zellen eingeleitet wird.

Diese Effektor-T-Zellen zirkulieren und wandern in verschiedene Organe, einschließlich der Lunge, wo sie sich als residente Gedächtnis-T-Zellen oder_T-RM-Zellen befinden, was zur Immunisierung führt.

Nach der Immunisierung wird intranasal ein antibiotikaresistenter Stamm von lebenden Bordetella pertussis verabreicht. Diese Bakterien dringen in das Lungengewebe ein und aktivieren_T-RM-Zellen. Die aktivierten_T-RM-Zellen sezernieren entzündliche Zytokine, die die Immunzellen rekrutieren, um eine bakterielle Clearance zu bewirken.

Ernten Sie das Lungengewebe der Maus und homogenisieren Sie es, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Verteilen Sie die verdünnte Zellsuspension auf einer antibiotikahaltigen Agarplatte und inkubieren Sie sie, um die Bildung einer Bakterienkolonie zu ermöglichen.

Der Gewebeextrakt einer immunisierten Maus weist im Vergleich zu dem einer nicht immunisierten Maus weniger Kolonien auf, was die impfstoffinduzierte Immunität gegen Bordetella pertussis bestätigt.

Bestätigen Sie für die Immunisierung ein fehlendes Ansprechen auf das Einklemmen der Zehen bei einer anästhesierten 6 bis 12 Wochen alten Maus und laden Sie eine 1-Milliliter-Insulinspritze mit einer 28,5-Gauge-Nadel mit 0,1 Millilitern des gewünschten Impfstoffs. Halten Sie die Spritze in einem 45-Grad-Winkel mit der Abschrägung nach oben, führen Sie die Nadel etwa 5 Millimeter in den Deltamuskel der Maus ein und injizieren Sie den Impfstoff.

Halten Sie die Nadel 5 bis 10 Sekunden lang in den Muskel eingeführt. Drehen Sie dann die Spritze um 180 Grad, so dass die Abschrägung nach unten zeigt, um eine Abdichtung zu erzeugen und ein Auslaufen des Impfstoffs zu verhindern, bevor Sie die Nadel langsam von der Injektionsstelle zurückziehen. Bringen Sie dann die Maus zurück in ihren Käfig und überwachen Sie sie, bis sie vollständig wiederhergestellt ist.

Infizieren Sie etwa zwei Wochen nach der Auffrischung immunisierte Mäuse. Fassen Sie eine betäubte Maus am Schopf des dorsalen Thorax hinter den Schulterblättern und dem Hals und positionieren Sie die Maus aufrecht, um Zugang zur Nase zu erhalten. Tragen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze langsam 20 bis 25 Mikroliter des interessierenden bakteriellen Inokulums auf jede Schicht des Tieres auf und halten Sie die Maus fest, bis das gesamte Inokulum eingeatmet wurde. Geben Sie dann einer Gruppe von Mäusen die gleiche Menge steriles PBS wie eine Negativkontrolle.

Platzieren Sie eine infizierte Maus am entsprechenden experimentellen Endpunkt mit der Bauchseite nach oben auf einem Sezierbrett und sichern Sie die Gliedmaßen. Befeuchten Sie den Körper mit 70% Ethanol und fassen Sie die Haut unterhalb des Bauches in der Mitte des Beckens mit einer Pinzette fest. Machen Sie mit einer scharfen Schere einen vertikalen Schnitt bis zum Unterkiefer und präparieren Sie die Haut von der Bauchfellwand. Bewegen Sie die Haut an die Seiten des Kadavers, um ein ungehindertes Feld für die sterile Organentnahme zu schaffen, und fassen Sie das intakte Bauchfell unterhalb des Brustkorbs an oder in der Nähe der Leber. Schneiden Sie das Bauchfell in Richtung Brustkorb, um den unteren Verdauungstrakt freizulegen, und verschieben Sie den Dickdarm nach links, um die Milz freizulegen.

Fassen Sie mit einer gebogenen Pinzette die Milz und präparieren Sie das Bindegewebe mit einer Schere. Legen Sie dann die Milz in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das 3 Milliliter RPMI und 5 % fötales Rinderserum auf Eis enthält. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Brustkorb am Xiphoid-Prozess zu stabilisieren, und schneiden Sie das Zwerchfell auf. Die Lunge sollte sich entleeren und in Richtung Wirbelsäule abfallen.

Schneiden Sie den Brustkorb an den Seiten auf, um den Brustpanzer zu entfernen, und schneiden Sie die Lungenarterien und -venen durch, um den oberen Lappen der rechten Lunge zu isolieren und zu entfernen. Befestigen Sie den Lappen mindestens 24 Stunden lang in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 % neutral gepuffertem Formalin bei Raumtemperatur und isolieren Sie die verbleibenden Lappen der rechten und linken Lunge. Legen Sie dann die Lappen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit 2 Millilitern 1 % Kasein in PBS auf Eis.

Verwenden Sie einen 1-Milliliter-PIPETMAN mit Spitze, um das Blut zu sammeln, das die Brusthöhle füllt, und geben Sie das Blut in ein vormarkiertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Entfernen Sie die Ohrspeicheldrüse, die sublingualen und subzillären Drüsen sowie die Lymphknoten, die die Luftröhre bedecken, und öffnen und entfernen Sie die Schutzmembranen, die die Luftröhre umgeben. Trennen Sie mit einer feinen Zange und einer Schere vorsichtig die Luftröhre von der Speiseröhre und alle anderen Bindegewebe von der Oberseite des Schlüsselbeins bis zur Unterseite des Unterkiefers.

Benutze eine Pinzette, um die Luftröhre zu halten, und schneide die Luftröhre an der Spitze des Schlüsselbeins durch. Ziehen Sie die Luftröhre nach unten, um die Elastizität zu maximieren, und schneiden Sie die Luftröhre am unteren Ende des Unterkiefers direkt über dem Kehlkopf, wobei Sie etwa 1 Zentimeter Gewebe isolieren. Legen Sie dann das Organ in ein vormarkiertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 0,3 Milliliter 1% Kasein in PBS auf Eis enthält.

Drehen Sie nun die Maus, um freien Zugang zur Nase zu erhalten, und besprühen Sie den Kopf mit 70 % Ethanol. Fassen Sie das Tier direkt hinter dem Schädel und schneiden Sie mit einer Schere das weiche Fleisch der Schnauze ab, beginnend von der Unterseite der Nase nach oben. Entferne das Fell, die Haut und die Schnurrhaare um die Nase herum und führe die Spitzen einer gebogenen Schere mit den Kurven nach unten in die Nasenlöcher ein.

Schneiden Sie den Nasengang zu den Augen hin auf, so dass eine V-förmige Formation entsteht. Verwenden Sie dann eine feine Pinzette, um das Nasenseptum und das Weichgewebe in der Formation zu sammeln, und legen Sie das Gewebe in ein vormarkiertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 0,3 Millilitern 1% Kasein in PBS auf Eis.

Um das Lungengewebe zu verarbeiten, geben Sie den gesamten Inhalt des Lungenprobenröhrchens in einen sterilen 15-Milliliter-Homogenisator und verwenden Sie einen Stößel, um das Gewebe zu homogenisieren. Dissoziieren Sie die Probe, bis keine großen Gewebepartikel mehr übrig sind, und geben Sie die homogenisierte Suspension wieder in das ursprüngliche 15-Milliliter-Röhrchen zurück. Ein 0,3-Milliliter-Aliquot zum Plattieren koloniebildender Einheiten wird entfernt und der Rest des Homogenats durch Zentrifugation aufgefangen.

Aliquotieren Sie 0,5 Milliliter des Überstands in vormarkierte Mikrozentrifugenröhrchen zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius bis zur Zytokinexpressionsanalyse mittels ELISA. Dann verdünnen Sie seriell 0,1 Milliliter Aliquots der stillgelegten homogenisierten Lungensuspension in 0,9 Milliliter sterilem PBS pro Verdünnung und verwenden Sie einen sterilen Dreiecksspreizer, um 0,1 Milliliter jeder empirisch gewählten Verdünnung auf vormarkierte 10%ige Bordet-Gengou- plus Streptomycin-Platten aufzutragen.