Organellendynamik in B-Lymphozyten nach Aktivierung mit antigenbeschichteten Kügelchen

B-Zell-Rezeptoren, BCRs, auf B-Lymphozyten binden Antigene, was zu einer Zellaktivierung führt. Dies führt zur Antigeninternalisierung für die Verarbeitung in Peptidfragmente, die auf MHC-Moleküle der Klasse II geladen werden, um sie den T-Helfer-Lymphozyten zu präsentieren, um eine effektive Immunantwort zu erzeugen.

Um die Aktivierung von B-Lymphozyten in vitro mit antigenbeschichteten Kügelchen zu untersuchen, erhalten Sie zunächst antigenbeschichtete Kügelchen. Diese Kügelchen sind kovalent mit Antigenen beschichtet, Liganden, die spezifisch für BCRs sind; ein nicht-reaktives Protein blockiert die ungebundenen Kügelchenstellen und verhindert so eine unspezifische Bindung an B-Lymphozyten.

Geben Sie die Kügelchen in die B-Lymphozytensuspension. Die Mischung auf ein mit Poly-L-Lysin beschichtetes Deckglas säen.

Die negativ geladenen B-Lymphozyten binden an das positiv geladene Deckglas und immobilisieren die Zellen. Darüber hinaus binden die Antigene der Kügelchen spezifisch an BCRs. Die Interaktion des BCR mit dem Antigen aktiviert B-Lymphozyten und bildet eine Tight Junction – eine Immunsynapse.

Die Interaktion initiiert intrazelluläre Signalwege, was zu einer Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts führt. Dies führt zu einer Ausbreitung der Zellmembran, gefolgt von einer Kontraktion, bei der sich der BCR-Antigen-Mikrocluster im Zentrum der Immunsynapse konzentriert.

Beim Aktin-Umbau positioniert sich das Zentrosom – ein Mikrotubuli-Organisationszentrum – in der Nähe der Synapse neu. Die Neupositionierung rekrutiert Organellen wie Lysosomen und den Golgi-Apparat in der Nähe der Immunsynapse, um Antigene zu extrahieren und zu präsentieren.

Antigenbeschichtete Kügelchen werden hergestellt, indem spezifische Liganden mit Aminokügelchen inkubiert werden, die zuvor mit Glutaraldehyd behandelt wurden, um Aminogruppen zu aktivieren. Resuspendieren Sie aktivierte Kügelchen in 100 Mikrolitern PBS und Vortex. In der Zwischenzeit bereiten Sie die Antigenlösung vor, indem Sie 100 Mikrogramm pro ml BCR-Ligand in 150 Mikroliter PBS hinzufügen.

Geben Sie anschließend 50 Mikroliter aktivierte Kügelchen in die Antigenlösung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius. Denken Sie daran, auch einen nicht verwandten Liganden als Negativkontrolle zu verwenden. Nach der Inkubation die Perle mit PBS waschen, den Überstand aspirieren und durch PBS ersetzen. Wiederholen Sie dies dreimal. Als nächstes blockieren Sie die freien Aminogruppen, indem Sie Kügelchen in 500 Mikrolitern einer BSA-Lösung resuspendieren. Zum Schluss resuspendieren Sie die Kügelchen in 70 Mikrolitern PBS.

Um die Endkonzentration zu berechnen, können Sie ein Hämozytometer verwenden, um die Kügelchen zu zählen. Für die B-Zell-Aktivierung verwenden Sie ein 50-ml-Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen auf eine Konzentration von 1,5 Millionen pro ml in CLICK, ergänzt mit 5 % fötalem Rinderserum. Als nächstes fügen Sie 150.000 B-Zellen, die 100 Mikrolitern des Zell-Kügelchen-Gemisches entsprechen, zu einem Poly-L-Lysin-beschichteten Deckglas hinzu und inkubieren bei 37 Grad für die verschiedenen Zeitpunkte.