Wirkung des Anti-C-fms-Antikörpers auf die Osteoklastogenese in Knochenmarkzellen der Maus in vitro

Die Osteoklastogenese ist der Prozess, bei dem sich Osteoklastenvorläufer differenzieren und zu mehrkernigen Osteoklasten verschmelzen.

Um die Wirkung des Anti-c-fms-Antikörpers auf die Osteoklastogenese in vitro zu untersuchen, nehmen Sie eine Kulturplatte, die eine Suspension aus Knochenmarkzellen der Maus enthält. Fügen Sie den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor M-CSF hinzu.

In Kultur bindet M-CSF an seinen spezifischen Rezeptor c-fms auf myeloischen Vorläuferzellen, aktiviert Signalwege und bewirkt die Differenzierung in Knochenmarkmakrophagen, BMMs, die Osteoklastenvorläufer darstellen und an der Platte haften.

Entfernen Sie die nicht adhärenten Zellen. Ernten Sie die BMMs und säen Sie sie in Multi-Well-Plattenvertiefungen aus. Ergänzung mit M-CSF und Rezeptoraktivator des Kernfaktor-Kappa-B-Liganden, RANKL.

Erhöhen Sie die Konzentrationen von Anti-c-fms-Antikörpern in die Vertiefungen.

In der Kontrollvertiefung bindet M-CSF an die c-fms-Rezeptoren und aktiviert Signalwege, stimuliert die Expression von RANK-Rezeptoren und fördert das Überleben und die Proliferation von BMM. RANKL bindet an die RANK-Rezeptoren, löst eine Signalkaskade aus und bewirkt die Differenzierung und Fusion von BMM mit Osteoklasten.

In Vertiefungen mit höheren Antikörperkonzentrationen binden und blockieren die Antikörper effektiv die c-fms-Rezeptoren und stören die für die Osteoklastendifferenzierung erforderliche Signalübertragung, wodurch die Osteoklastenbildung gehemmt wird.

Durchführung von Färbungen zur Identifizierung und Quantifizierung der Osteoklastenpopulationen und Bestimmung der wirksamen Antikörperkonzentration zur Hemmung der Osteoklastogenese bei der RANKL-induzierten Osteoklastenbildung.

Säen Sie 10 Millionen Zellen pro 10 Milliliter in einer 10-Zentimeter-Kulturschale aus und fügen Sie den Zellen M-CSF hinzu. Inkubieren Sie die Kultur 3 Tage lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie das Medium nach drei Tagen und waschen Sie die Zellen zweimal kräftig mit 10 Millilitern PBS, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen.

Fügen Sie 5 Milliliter 0,02 % Trypsin-EDTA bei Raumtemperatur in PBS hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Pipettieren Sie die Zellen gründlich, um sie zu lösen. Beobachten Sie die Kultur unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich die Zellen abgelöst haben und rund und schwebend im Medium erscheinen.

Wenn die Zellen abgelöst wurden, inaktivieren Sie die Reaktion durch Zugabe von 5 Millilitern Alpha-MEM. Die Zellen werden in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gegeben und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert. Nach dem Entleeren des Überstands mit 5 Millilitern alpha-MEM waschen und erneut bei 300 x g 5 Minuten zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern Alpha-MEM.

1 Million Zellen pro 10 Milliliter in eine 10-Zentimeter-Kulturschale aussäen und M-CSF hinzufügen. Inkubieren Sie die Kultur 3 Tage lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Ernten Sie die angehängten Zellen, die BMMs als Osteoklastenvorläufer darstellen, nach 3 Tagen. Seed-BMMs in einer Menge von 50.000 Zellen pro 200 Mikroliter alpha-MEM in einer 96-Well-Platte pro Well.

Fügen Sie jeder Vertiefung die gewünschten Stimuli hinzu und fügen Sie dann M-CSF für eine Endkonzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter hinzu. Geben Sie Anti-c-fms-Antikörper in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte 4 Tage lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, während Sie 4 Tage lang jeden zweiten Tag das Medium wechseln, und fahren Sie dann mit der Färbung und den Tests fort, wie im Manuskript beschrieben.