Hämatoxylin- und Eosin-Färbung zur Beurteilung von Dickdarmschäden bei DSS-induzierter Kolitis

Dextransulfat-Natrium oder DSS induziert Kolitis - eine entzündliche Darmerkrankung -, bei der eine Störung der Darmepithelbarriere zu Entzündungen führt.

Um die Gewebeschädigung zu beurteilen, nehmen Sie fixiertes Dickdarmgewebe, das aus einem Mausmodell der DSS-induzierten Kolitis isoliert wurde. Tauchen Sie das Gewebe in ein Einbettungsmedium, um es leicht schneiden zu können, und frieren Sie es schnell ein.

Entnehmen Sie mit einem Kryo-Mikrotom einen dünnen Gewebeschnitt und sammeln Sie ihn auf einem Objektträger.

Tauchen Sie den Objektträger in eine Lösung, die oxidierten Hämatoxylin-Farbstoff enthält, der an ein Beizmittel – ein Metallkation – gebunden ist und dem Farbstoff eine positive Ladung verleiht. Der Farbstoff-Beizmittel-Komplex bindet an negativ geladene DNA und färbt den Zellkern rötlich-violett.

Tauchen Sie das Gewebe in eine differenzierende Säure-Alkohol-Lösung, wobei Sie unspezifisch gebundene Farbstoffe aus dem Zytoplasma und der extrazellulären Matrix entfernen. Spülen Sie das Gewebe mit einem Bläuungsmittel – einem alkalischen Medium – ab, das den Zellkernen eine blaue Farbe verleiht und den Kontrast verstärkt.

Tauchen Sie den Objektträger in steigende Alkoholkonzentrationen, um das Gewebe zu dehydrieren und das Eindringen von Gegenflecken zu verbessern.

Tauchen Sie das Gewebe in den Gegenfleck – saure Eosinlösung – und verleihen Sie den grundlegenden zytoplasmatischen Proteinen und der extrazellulären Matrix eine rosa Farbe. Waschen Sie den Objektträger mit Alkohol, um überschüssiges Eosin zu entfernen. Tauchen Sie das Gewebe in Xylol, um das Gewebe transparent zu machen – für eine bessere mikroskopische Untersuchung.

Unter dem Mikroskop zeigt der Dickdarmschnitt eine verschlimmerte Gewebeschädigung, was auf eine DSS-induzierte Kolitis hinweist.

Für die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung des isolierten Dickdarmgewebes tauchen Sie die Gewebestücke am nächsten Morgen über Nacht in 30% Saccharose in PBS in einzelne 15-Milliliter-Röhrchen zum Kryoschutz der Proben. Am nächsten Tag betten Sie das Gewebe in eine optimale Schnitttemperatur oder OCT-Verbindung ein und kühlen Sie das Gewebe bei minus 20 Grad Celsius ab, bis das OCT aushärtet.

Legen Sie die OCT-Blöcke in einen Kryostaten und stellen Sie den Dickenregler auf 12 Mikrometer, dann schneiden Sie 12 Mikrometer dicke gefrorene Schnitte und sammeln Sie sie auf Glasmikroskop-Objektträger. Wenn alle Gewebe geschnitten wurden, erwärmen Sie die Objektträger 20 Minuten lang bei 65 Grad Celsius auf einer heißen Platte und waschen Sie die erhitzten Schnitte kurz in destilliertem Wasser, bevor Sie sie 5 Minuten lang mit Hämatoxylin-Färbelösung färben.

Entfernen Sie die überschüssige Hämatoxylinlösung 5 Minuten lang in fließendem Leitungswasser und differenzieren Sie die Abschnitte 30 Sekunden lang mit 0,5 % Salzsäure in Ethanol, gefolgt von einer 1-minütigen Spülung unter fließendem Leitungswasser. Waschen Sie die Proben anschließend 1 Minute lang in PBS, gefolgt von einer weiteren 5-minütigen Wäsche unter fließendem Leitungswasser.

Tauchen Sie das Gewebe am Ende des Waschvorgangs 10 Sekunden lang pro Eintauchen in eine aufsteigende Ethanolserie ein, gefolgt von einer Gegenfärbung in Eosin für 2 Minuten. Zur Dehydrierung der Proben tauchen Sie die Objektträger 5 Minuten lang pro Eintauchen in 95 % Ethanol und 2 Wechsel von 100 % Ethanol, gefolgt von einer Reinigung mit zwei 5-minütigen Xylolwechseln. Bewerten Sie dann die Gewebeschäden am proximalen, mittleren und distalen Dickdarm jeder Versuchsgruppe.