In vitro Biofilmsynthese durch Staphylococcus aureus

Bakterielle Biofilme sind dreidimensionale Strukturen, die aus Bakteriengemeinschaften bestehen, die in eine selbst erzeugte extrazelluläre Matrix eingebettet sind und sich der Immunantwort des Wirts entziehen.

Für die In-vitro-Herstellung von Staphylococcus aureus-Biofilmen wird eine aktiv wachsende Staphylococcus aureus-Suspension mit der gewünschten Zelldichte in die Poly-L-Lysin-beschichteten Wells einer Multi-Well-Platte überführt.

Während der Inkubation unter statischen Bedingungen erleichtert die positiv geladene Poly-L-Lysin-Beschichtung elektrostatische Wechselwirkungen mit den negativ geladenen Glykopolymeren, wie z. B. Teichonsäuren, auf der Bakterienoberfläche und fördert so die Anheftung der Bakterien.

Mit den verfügbaren Nährstoffquellen teilt sich Staphylococcus aureus und sammelt sich an und bildet Mikrokolonien. Darüber hinaus sezernieren die Bakterien eine extrazelluläre Matrix aus Polysacchariden, Proteinen und extrazellulärer DNA, die die Zellen umhüllt und den bakteriellen Zusammenhalt und die Oberflächenadhäsion fördert.

Mit fortschreitender Zellteilung und Matrixsekretion reift der Biofilm zu einer dreidimensionalen Struktur mit effizienter Signalmolekülverteilung für die Zell-zu-Zell-Kommunikation.

Bei Erreichen einer Schwellenwert für die Bakteriendichte sezerniert Staphylococcus aureus Proteasen und Nukleasen, wodurch die Biofilmmatrix abgebaut und einige Staphylococcus aureus an das Medium abgegeben werden. Entfernen Sie die Medien, die frei schwebende, planktonische Bakterien enthalten.

Fügen Sie vorsichtig einen Puffer hinzu, um eine Zerstörung des Biofilms zu verhindern. Entfernen Sie den Puffer, der alle verbleibenden nicht anhaftenden Bakterien enthält.

Der erzeugte Biofilm ist bereit für nachgelagerte Experimente.

Beginnen Sie mit der Gewinnung isolierter Kolonien von Staphylococcus aureus aus einem kryokonservierten Bestand mit einer Streifenplattentechnik auf einer nährstoffreichen Agarplatte, wie z. B. tryptischem Soja-Agar. Beschichten Sie einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern PLL, verdünnt in sterilem Wasser, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die PLL-Lösung wird aseptisch mit einer vakuumunterstützten Aspirationsfalle aspiriert. Lassen Sie die Vertiefungen über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.

Bereiten Sie eine Übernachtkultur vor, indem Sie eine Kolonie von S. aureus in MEM-alpha beimpfen, die mit 2 % Glukose ergänzt wird, und inkubieren Sie sie 16 bis 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 200 Umdrehungen pro Minute. Verdünnen Sie die Übernachtkultur, indem Sie 50 Mikroliter auf 5 Milliliter frisches MEM-alpha umfüllen, das mit 2 % Glukose ergänzt wird. Inkubieren Sie es dann bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute, bis die mittlere logarithmische Phase erreicht ist. Verwenden Sie MEM-alpha, um die mittlere logarithmische Kultur auf einen OD von 0,1 zu normalisieren.

Übertragen Sie 150 Mikroliter normalisierter Kultur in jede Vertiefung der PLL-behandelten 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für 18 bis 20 Stunden. Aspirieren Sie den Überstand, um die planktonischen Zellen zu entfernen. Waschen Sie die restliche Biomasse vorsichtig mit 150 Mikrolitern HBSS, um die nicht gebundenen Zellen zu entfernen. Wiederholen Sie dies mindestens zweimal, um alle Planktonzellen zu entfernen.