Eine In-vitro-Technik zur Stimulation von Lymphozyten über pathogene Bakterien

Um Lymphozyten über Haemophilus influenzae – ein pathogenes Bakterium – zu stimulieren, nehmen Sie eine Suspension von isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), einschließlich Lymphozyten und Antigen-präsentierenden Zellen oder APCs, ein.

Fügen Sie eine Bakteriensuspension hinzu und inkubieren Sie sie bei physiologischer Temperatur.

Mustererkennungsrezeptoren auf den APCs binden an bestimmte Bestandteile der Bakterienzellen und lösen so die Phagozytose aus. Das Phagosom – das internalisierte Bakterien enthält – verschmilzt mit dem Lysosom, was zu einem bakteriellen Abbau und einer Verarbeitung zu Peptidfragmenten führt.

MHC-Moleküle binden an die Peptidfragmente und präsentieren sie auf der Zelloberfläche als Antigene. T-Lymphozyten binden über den T-Zell-Rezeptor an das vorgestellte Antigen.

Fügen Sie co-stimulatorische Antikörper hinzu, die an spezifische Oberflächenrezeptoren auf T-Lymphozyten binden. Die synergistische Bindung induziert die nachgeschaltete Signalübertragung und aktiviert die Produktion von T-Lymphozyten-Zytokinen.

Fügen Sie eine Golgi-blockierende Verbindung hinzu, die den vesikulären Proteintransport vom endoplasmatischen Retikulum zum Golgi blockiert, um die Zytokinsekretion von T-Lymphozyten zu hemmen und die intrazelluläre Zytokinakkumulation zu erleichtern.

Fügen Sie ein Fixiermittel hinzu, um die Zellmorphologie zu erhalten, und ein Detergensmittel, um die Zellmembran zu permeabilisieren. Fügen Sie einen Cocktail aus fluoreszenzmarkierten Antikörpern hinzu, darunter Antikörper, die an die T-Lymphozyten-spezifischen Oberflächenmarker binden – die die Zelloberfläche markieren – und Zytokin-spezifische Antikörper, die in das Innere der Zelle eindringen, um intrazelluläre Zytokine zu binden.

Führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um Zellen mit dualer Fluoreszenz zu detektieren – was auf die Zytokinproduktion durch stimulierte T-Lymphozyten hinweist.

Teilen Sie die periphere Blutprobe zur Kontrolle und Antigenstimulation in Aliquote auf. Geben Sie co-stimulatorische Antikörper zu beiden Proben, fügen Sie dann das nicht typisierbare H. influenzae zur Antigenprobe hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Geben Sie anschließend den Golgi-Blocker Brefeldin A zu den Proben und inkubieren Sie sie weitere fünf Stunden lang. Nachdem Sie die Erythrozyten wie zuvor gezeigt lysiert haben, fixieren Sie die Leukozyten 1 Stunde lang mit 500 Mikrolitern 1% bis 2% Paraformaldehyd. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und permeabilisieren Sie dann 1 Million Zellen 15 Minuten lang mit 100 Mikrolitern 0,1 % Saponin.

Inkubieren Sie anschließend die Zellen mit geeigneten fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Waschen Sie die Zellen und analysieren Sie sie dann mit einem Durchflusszytometer. Bestimmen Sie den Anteil der Antigen-responsiven Zellen durch Gating der relevanten Lymphozytenpopulationen. Führen Sie eine Hintergrundfärbung an nicht stimulierten Zellen für alle zu analysierenden Zytokine durch.