Lateral Fluid-Percussion: Modell Schädel-Hirn-Verletzungen in Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine leichte bis mittelschwere Hirnverletzung bei Mäusen zu induzieren, um ein menschliches Schädel-Hirn-Trauma zu modellieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine C-Kraniektomie durchgeführt wird. Der zweite Schritt des Eingriffs besteht darin, eine Nabe am Schädel über der Kraniektomiestelle anzubringen.

Als nächstes wird ein Wasserimpuls durch die Nabe abgegeben, um eine Hirnverletzung auszulösen. Der letzte Schritt des Eingriffs besteht darin, die Nabe zu entfernen und die Wunde zu schließen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die morphologische und Verhaltensänderungen in verschiedenen Abständen nach der Verletzung durch Immunfluoreszenz, Mikroskopie, kognitive und motorische Tests zeigen.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, die Kraniektomie durchzuführen, ohne einen Bruch in der Dura zu verursachen, und auch die Nabe zu befestigen, ohne dass Klebstoff auf die Dura gelangt. Daher ist die visuelle Demonstration dieser Technik äußerst wertvoll. Demonstration des Verfahrens wird fuka Ein Techniker aus meinem Labor Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Operationsbereichs.

Statten Sie ein stereotaktisches Instrument mit einem Gaskopfhalter für die kontinuierliche Inhalation der Anästhesie während der Operation aus. Positionieren Sie als nächstes ein Operationsmikroskop und eine Lichtquelle nach Bedarf. Bereiten Sie das Wärmekissen vor, das während der Operation unter die Maus gelegt wird, und stellen Sie sicher, dass alle Werkzeuge und Materialien, die mit der Operationsstelle in Berührung kommen, steril sind.

Sobald der Operationsbereich fertig ist, stellen Sie die Nabe her, die am Schädel befestigt wird, und verbinden Sie sie mit dem LFP-Gerät. Schneide mit einer Rasierklinge das Metallende eines 20 Gauge 1/2 Zoll langen Nadelschnitts mit einer leichten Vorspannung ab. Die Nabe sollte eine Öffnung von etwa drei Millimetern haben.

Schneiden Sie als Nächstes etwa einen Millimeter dicke Scheiben aus der Unkrautvernichter-Linie. Diese werden verwendet, um den Zinken beim Bohren des Schädels zu stabilisieren. Nachdem die Maus betäubt wurde, setzen Sie das Tier auf das stereotaktische Instrument und befestigen Sie den Kopf im Nasenkonus.

Denken Sie daran, die Atemfrequenz während der Operation visuell zu überwachen. Tragen Sie anschließend Salbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern und die Haare vom Kopf zu entfernen. Reinigen und sterilisieren Sie die Operationsstelle mit wiederholten Anwendungen von Povidon-Jodlösung, gefolgt von 70% Alkohol.

Nachdem die Operationsstelle vorbereitet ist, verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt in der Mittellinie vorzunehmen, der von den Augen bis zum Hals reicht. Ziehen Sie die Haut mit kleinen Bulldoggenklammern zurück. Um den Schädel freizulegen und ein klares Operationsfeld zu schaffen, tragen Sie das topische Anästhetikum Bupivacain mit einem zahnärztlichen Werkzeug oder Knochenschaber auf den Schädel auf und entfernen Sie die Faszie von der Oberseite des Schädels.

Machen Sie als Nächstes eine Markierung auf halbem Weg zwischen Bgma und Lambda und zwischen der sagittalen Naht und dem lateralen Kamm über der rechten Hemisphäre. Geben Sie einen Tropfen Loctite-Kleber auf ein Kunststoffgewebe und tauchen Sie mit einer seitlichen Greifzange eine der zuvor vorbereiteten Scheiben in den Kleber. Drücken Sie die Scheibe auf die Markierung auf dem Schädel.

Verwenden Sie eine Nadel und eine Spritze, um ein bis zwei Tropfen des Loctite-Beschleunigers hinzuzufügen. Um den Kleber zu härten, legst du ein Triffin mit einem Außendurchmesser von drei Millimetern über die Scheibe und drehst es im Uhrzeigersinn, bis du den Schädel durchtrennt hast. Prüfen. Das Tablett findet häufig Fortschritte, um zu weites Bohren und Durchbrechen der Dura zu vermeiden.

Der Schädellappen sollte sich locker anfühlen, wenn er leicht gedrückt wird. Platzieren Sie ein zahnärztliches Werkzeug parallel zur Schädeloberfläche und hebeln Sie damit den Knochenlappen auf. Löse den Knochen vorsichtig mit einer Pinzette vom Schädel.

Üben Sie mit einem Baumwollapplikator Druck aus, um Blutungen zu stoppen und zu verhindern, dass Knochenstaub auf die Dura gelangt. Liegt ein sichtbarer Riss in der Dura vor, sollte das Tier durch humane Euthanasie aus dem Versuch ausgeschlossen werden. Setze die Nabe mit einer Pinzette so über dem Loch an, dass die Vorspannung der Nabe mit der Krümmung des Schädels übereinstimmt.

Tragen Sie mit einem scharfen Holzstab mit einer Hand Sekundenkleber um die Kanten der Nabe auf, während Sie sie mit der anderen Hand stabilisieren. Achten Sie darauf, dass kein Klebstoff auf die Dura gelangt, da dies zu einer Verringerung der Verletzungskraft führen oder einen Riss auslösen kann, wenn die Nabe später entfernt wird. Mischen Sie Sano-Acryl und Dental-Acryl in einem kleinen Pappbecher.

Verwenden Sie eine Ein-cm³-Spritze, um Zement um die Nabe aufzutragen. Der Zement sollte die unteren zwei Millimeter der Nabe sowie den umgebenden freiliegenden Schädel bedecken. Füllen Sie die Nabe mit steriler Kochsalzlösung, um die Durra während der Erholungsphase feucht zu halten.

Ein Leck ist wahrscheinlich, wenn die Lösung nicht waagerecht bleibt, und eine neue Nabe sollte angebracht werden, um dem Tier Flüssigkeiten zu verabreichen und es in einen erwärmten leeren Käfig ohne Drahtdeckel zu bringen. Geben Sie etwas Hydrogel in den Boden und lassen Sie die Mäuse ein bis zwei Stunden lang sich erholen. Die Bestandteile des LFP-Gerätes sind ein Pendel, ein wassergefüllter Acrylzylinder mit Hochdruckschlauch und einem angebrachten männlichen Köderschloss, ein Verstärker und ein Oszilloskop.

Schalten Sie zunächst das Oszilloskop und den Verstärker ein. Vergewissern Sie sich, dass das LFP-Gerät und der daran angeschlossene Hochdruckschlauch mit dem männlichen Ende des Köderverschlussrohrs mit Wasser gefüllt und frei von Luftblasen sind. Anbei. Lassen Sie das Pendel los, um einen Prüfimpuls abzugeben.

Geben Sie mehrere Impulse ab und bestätigen Sie, dass das Pendel ein gleichmäßiges Signal auf dem Oszilloskop und dem Verstärker abgibt. Ein lautes Signal weist auf Luft im System hin, die vor der Abgabe des Verletzungsimpulses entfernt werden muss. Überwachen Sie den vom Gerät abgegebenen Druck, um die Konsistenz der Verletzung aufrechtzuerhalten.

Die Oszilloskop-Spur zeigt hier einen Spitze-zu-Spitze-Wert von 2,16 Volt, was auf einen Druck von 1,47 Atmosphären hinweist. Der Winkel des Pendels kann vergrößert oder verringert werden, um die Intensität des Impulses zu verändern. Hier beträgt der Winkel ca. 10 Grad.

Nachdem Sie das LFP-Gerät eingestellt haben, stellen Sie sicher, dass Sie das Köderschlossende des Schlauchs öffnen. Sobald das LFP-Gerät fertig ist, legen Sie eine betäubte Maus auf die Plattform und füllen Sie die Nabe mit steriler Kochsalzlösung. Befestigen Sie das männliche Köderschloss vom LFP-Gerät an der weiblichen Köderverriegelung der Nabe.

Legen Sie das Tier auf die Seite und sobald ein normales Atemmuster wieder aufgenommen wird, aber bevor das Tier wieder empfindlich wird, lassen Sie das Pendel los, um einen einzelnen Verletzungsimpuls zu verursachen. Der genaue Druck des Impulses sollte aufgezeichnet werden. SHA-Tiere durchlaufen alle die gleichen Verfahren, mit Ausnahme des eigentlichen Flüssigkeitsimpulses, um Verletzungen herbeizuführen.

Legen Sie das Tier auf den Rücken, um die Schreibreflexzeit zu überwachen. Nachdem sich das Tier selbst geschrieben hat, wird es noch einmal kurz betäubt. Entferne den Zement und die Nabe vom Schädel.

Notieren Sie das Vorhandensein eines Hernias der Dura und verschließen Sie die Wunde dann mit Vet Bond Tissue-Kleber. Überprüfen Sie die Nabe visuell auf Verdeckungen. Setzen Sie das Tier bis zur Gehfähigkeit in einen warmen Käfig und bringen Sie es dann in seinen Heimatkäfig zurück.

Verhaltenstests nach LFP können verwendet werden, um sowohl kognitive als auch motorische Ergebnisse zu bewerten. Das Morris-Wasserlabyrinth wird verwendet, um die Auswirkungen auf das Lernen und das Gedächtnis anhand visueller Hinweise im Testraum zu bestimmen. Scheinmäuse werden effizienter beim Auffinden der Plattform.

Mit jedem weiteren Trainingstag brauchen meine LFP-Betroffenen an den ersten beiden Testtagen im Vergleich zu Scheinmäusen länger, um die versteckte Plattform zu lokalisieren, scheinen dann aber am dritten Tag die Aufgabe zu lernen. Um die Wirkung von Verletzungen auf die Gedächtnisleistung zu bestimmen. Ein Sondenversuch wird einen Tag nach der letzten Trainingseinheit durchgeführt.

Scheinmäuse verbringen im Vergleich zu den Mäusen, die LFP ausgesetzt sind, mehr Zeit im Zielquadranten. Die durch LFP verursachten motorischen Defizite können mit dem Rotorteppichtest M bestimmt werden, der einer LFP unterzogen wurde, die im Vergleich zu den Scheinmäusen sieben und 21 Tage nach der Verletzung eine kürzere durchschnittliche Latenz bis zum Sturz aufweist. Die Färbung des sauren Ggl-Fibrillenproteins zeigt eine erhöhte Gliose im gesamten Kortex im Bereich der Verletzung, während Scheinmäuse keine erhöhte Astrozytenzahl an der entsprechenden Stelle aufweisen.

In ähnlicher Weise zeigt die MAC-Eins-Färbung mehr Makrophagen, die die Verletzungsstelle umgeben, verglichen mit Mäusen, die einer Scheinoperation unterzogen wurden. Darüber hinaus ist bei Mäusen, die LFP ausgesetzt sind, häufig eine physische Schädigung des kortikalen Gewebes sichtbar, nicht jedoch bei Scheinmäusen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass Sie die Dura nicht durchbrechen sollten und dass das LFP-Gerät frei von Luftblasen sein sollte.

Diese Technik ermöglicht es Neurowissenschaftlern, verschiedene pharmakologische und genetische Manipulationen vor oder nach einer Verletzung zu bewerten. Bei Mäusen. Dies wird dazu beitragen, herauszufinden, welche Moleküle die neuronale Degeneration reduzieren oder die Regeneration bei Patienten mit traumatischen Hirnverletzungen fördern.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie bei einem Nagetiermodell eine leichte bis mittelschwere traumatische Hirnverletzung auslösen können, indem Sie eine Kraniektomie durchführen, eine Nabe am Schädel befestigen und einen Wasserdruckimpuls durch die Nabe auf die Duramaterie senden.