Abtötung von K562-Zellen durch mononukleäre Zellen des peripheren Blutes, die Tabakzubereitungen ausgesetzt waren

Tumorzellen aktivieren Effektor-Immunzellen, um Zytokine und zytolytische Granula freizusetzen, die Perforin und Granzyme enthalten. Perforin bildet Poren in der Tumorzellmembran, die den Eintritt des Granzyms in die Zelle erleichtern und die Apoptose einleiten, was zum Zelltod führt.

Um die zytolytische Funktion von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes, PBMCs, nach der Tabakproduktzubereitung, TPP, Exposition zu analysieren, wird eine Multi-Well-Platte mit steigenden TPP-Konzentrationen verwendet. Als Kontrolle fungiert eine medienhaltige Vertiefung.

Fügen Sie eine PBMC-Suspension hinzu. Das primäre Immunsuppressivum der TPPs, Nikotin, bindet an die nikotinischen Acetylcholinrezeptoren der Effektor-PBMCs und reguliert die entzündungsfördernde Zytokinproduktion herunter.

Zentrifuge. Entfernen Sie den TPP-haltigen Überstand. Unterbrechen Sie die PBMCs in den Medien erneut. Fluoreszenzmarkierte K562-Zellen, menschliche leukämische Zellen mit einer erhöhten Anfälligkeit für die Zytotoxizität von PBMC-Effektorzellen, werden in die Vertiefungen gegeben.

TPP-behandelte Effektorzellen mit unterdrückten Immunantworten weisen eine verminderte Perforin-Expression und Zytokinfreisetzung auf, wodurch die zytolytische Fähigkeit des PBMC verringert wird.

Zentrifuge. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Puffer, gefolgt von einem zellundurchlässigen Fluoreszenzfarbstoff. Der Farbstoff dringt mit geschädigten Membranen in die Zellen ein und färbt die DNA.

Bestimmen Sie mit einem Durchflusszytometer den Anteil an toten und lebenden K562-Zellen in den Vertiefungen. Ein geringerer Prozentsatz toter K562-Zellen in Vertiefungen mit höheren TPP-Konzentrationen als die Kontrolle deutet auf eine Unterdrückung der Abtötung von K562-Zellen durch TPP-behandelte PBMCs hin.

Nach der Vorbereitung einer Platte mit mit Tabakprodukten behandelten PBMCs, wie gerade gezeigt, waschen Sie eine Kultur von K562-Zellen, die bei einer Konfluenz von 80 % in 10 Millilitern DPBS geerntet wurden. Resuspendieren Sie das Pellet in 5 Millilitern DPBS und zählen Sie die Zellen. Geben Sie dann 1 Milliliter frisch zubereiteter CFSE-Arbeitslösung zu 1 bis 2 mal 10 zu den siebten K562-Zellen in 1 Milliliter vollständigem Medium und dispergieren Sie die Zellfärbung durch Vortexen.

Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur. Nach genau 2 Minuten fügen Sie 200 Mikroliter FBS hinzu und wirbeln Sie die Zellen erneut durch und inkubieren Sie sie weitere zwei Minuten lang.

Nach der zweiten Inkubation waschen Sie die Zellen in 10 Millilitern vollständigem Medium. Suspendieren Sie dann das Pellet in weiteren 10 Millilitern vollständigem Medium und zählen Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie nun die mit Tabak behandelten PBMCs und dekantieren Sie den Überstand. Setzen Sie dann die Abdeckung wieder auf, resuspendieren Sie die Zellen durch Vortexen und waschen Sie sie in 200 Mikrolitern vollständigem Medium pro Vertiefung.

Um den Tötungstest zu starten, fügen Sie die CFSE-markierten K562-Zellen in einem Verhältnis von 1 zu 15 zu den PBMCs hinzu und inkubieren Sie die Co-Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Nach fünf Stunden schleudern Sie die Zellen herunter und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Pellets durch Vortexen und waschen Sie die Zellen dann mit 200 Mikrolitern Laufpuffer pro Well. Fügen Sie dann 95 Mikroliter Laufpuffer hinzu, gefolgt von 5 Mikrolitern 7-AAD, für ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern pro Well.

Inkubieren Sie die Zellen schließlich 15 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur, fügen Sie dann 100 Mikroliter Laufpuffer in jede Vertiefung hinzu und übertragen Sie das gesamte Volumen in die entsprechenden FACS-Röhrchen, um den Prozentsatz der 7-AAD- und CFSE-positiven Zellen durch durchflusszytometrische Analyse zu bestimmen.