Eine In-vitro-Technik zur Untersuchung antimikrobieller Behandlungen an bakteriellen Aggregaten

Um die Auswirkungen von Antibiotika auf bakterielle Aggregate zu untersuchen, nehmen Sie Pseudomonas aeruginosa-Kultur in einem Wachstumsmedium, das die Aggregatbildung fördert und das Wachstum während der Infektion simuliert.

Die gentechnisch veränderten Bakterien exprimieren ein fluoreszierendes Protein für den Aggregatnachweis unter einem Fluoreszenzmikroskop. Stellen Sie ein dreidimensionales Bild auf, um das Volumen der Aggregate oder der bakteriellen Biomasse zu berechnen und die Zunahme der Biomasse im Laufe der Zeit zu visualisieren, was auf das Bakterienwachstum hinweist.

Fügen Sie Colistin – ein kationisches antimikrobielles Peptid – in einer subletalen Konzentration hinzu, die anfällige Bakterien abtötet, während Sie die antibiotikatoleranten auswählen.

Colistin bindet an negativ geladene Lipopolysaccharide (LPS) auf der bakteriellen Außenmembran und verdrängt kationische Brücken, die die LPS-Monoschicht stabilisieren – und beschädigt so die Membranintegrität.

Colistin dringt in das Periplasma ein und bindet an LPS auf der Zellmembran, wodurch die Membran gestört und die Zelllyse eingeleitet wird. Als Gegenmechanismus neutralisieren spezifische genetische Mutationen in einer Untergruppe von Bakterien die negative Ladung von LPS. Diese Modifikation hemmt die elektrostatische Wechselwirkung von kationischem Colistin mit weniger anionischem LPS – und verhindert so den Zelltod.

Bild, um die verringerte Biomasse im Laufe der Zeit zu visualisieren und die Wirkung des antimikrobiellen Mittels anzuzeigen. Fügen Sie Propidiumiodid oder PI hinzu - einen Fluoreszenzfarbstoff -, der durch die beschädigte Membran eindringt, um DNA zu binden und nur die toten Zellen zu markieren.

Führen Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) durch, bei der PI-markierte anfällige Zellen von fluoreszenzmarkierten antibiotikatoleranten Zellen getrennt werden. Die Zellen sind bereit für nachgelagerte Assays.

Um die Pseudomonas aeruginosa-Aggregate mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop abzubilden, bestimmen Sie am Ende der Inkubation drei Vertiefungen der Kulturplatte, da die Antibiotikabehandlung in einer Vertiefung repliziert wird, und legen Sie die Platte auf den beheizten Tisch des Mikroskops.

Wählen Sie ein 63-faches Ölimmersionsziel aus und öffnen Sie die Registerkarte Lokalisieren, um die Bakterienaggregate im Hellfeld zu identifizieren. Definieren Sie einen Bereich für die Bildgebung innerhalb jedes Wells und verwenden Sie das Modul Positionen, um die Bereichsposition zu speichern. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 488 Nanometer und die Emissionswellenlänge auf 509 Nanometer ein.

Wählen Sie im Erfassungsmodul die Option Z-Stapel aus, um die Bilder zu erfassen, und verwenden Sie das Modul Linienmittelung, um die Hintergrundfluoreszenz im GFP-Kanal innerhalb des Gesamtvolumens der Z-Stapel-Bilder zu reduzieren. Legen Sie die Option Zeitreihe fest, um 18 Stunden lang 60 Schichten in jedem Well in 15-Minuten-Intervallen zu erfassen, und verwenden Sie die Definitivfokusstrategie, um für jede Position eine Fokusebene zu speichern, die zu jedem Zeitpunkt während des Experiments erneut abgebildet wird.

4,5 Stunden nach dem Aufbau des Bildgebungsexperiments wird jede Position abgebildet, um die aggregierte Biomasse in jeder der vier Vertiefungen vor der Zugabe des Antibiotikums zu bestimmen. Geben Sie nach sechs Stunden vorsichtig ein Antibiotikum mit dem Zweifachen unter der minimalen Hemmkonzentration in die Mitte jeder Vertiefung, direkt unter der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, und klicken Sie auf Experiment starten, um mit der Bildgebung nach der Antibiotikabehandlung zu beginnen.

Um die lebenden Zellen zu isolieren, markieren Sie die Bakterien in jeder Vertiefung am Ende der 18-stündigen Bildgebungsphase gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit dem entsprechenden Volumen an Propidiumiodid. Verwenden Sie am Ende der Inkubation einen isolierten Behälter, um die Platte auf das Durchflusszytometer zu übertragen, und stellen Sie das Zytometer so ein, dass GFP und Propidiumiodid mit einer 70-Mikron-Düse nachgewiesen werden. Führen Sie dann 1-Milliliter-Aliquots jedes Kulturüberstands bei der niedrigsten Flussrate durch, um die lebensfähigen GFP-positiven und nicht lebensfähigen Propidiumiodid-negativen Pseudomonas aeruginosa-Aggregate zu sortieren.