Quantifizierung der bakteriellen Infektion in Wirtszellen durch den koloniebildenden Unit-Assay

Um mit dem Assay der koloniebildenden Einheit (KBE) zur Quantifizierung lebensfähiger Bakterien zu beginnen, nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit kultivierten Makrophagen in Wachstumsmedien. Infizieren Sie die Makrophagen mit Listeria monocytogenes, einem pathogenen Bakterium, das zu intrazellulärem Wachstum fähig ist.

Während der Infektion verschlingen die Makrophagen die Bakterien und internalisieren die Bakterien in einem membrangebundenen Kompartiment – einem Phagosom

.

Bakterien scheiden ein porenbildendes Toxin aus und stören die phagosomale Membran. Dabei können die Bakterien in das Zytosol eindringen und sich in den Makrophagen vermehren.

Behandeln Sie die infizierten Makrophagen kurzzeitig mit Gentamicin, einem Antibiotikum, das selektiv nicht internalisierte Bakterien eliminiert und gleichzeitig intrazelluläre Bakterien bewahrt.

Aspirieren Sie die darüber liegenden medien, die Antibiotika enthalten. Als nächstes fügen Sie steriles destilliertes Wasser über die infizierten Makrophagen hinzu, wodurch eine hypotone Umgebung entsteht. Dies führt zur Osmose, bei der Wassermoleküle in die Zellen eindringen und eine Makrophagenlyse verursachen, bei der die intrazellulären Komponenten, einschließlich der Bakterien, freigesetzt werden.

Verteilen Sie das Zelllysat, das intrazelluläre Bakterien enthält, auf die Lysogenie-Agarplatte, um die Trennung einzelner Bakterienzellen zu fördern und ihr unabhängiges Wachstum zu ermöglichen. Während der Inkubation wachsen lebensfähige Bakterien auf der Agaroberfläche und bilden unterschiedliche Kolonien.

Zählen Sie die Kolonien auf der Platte und erhalten Sie die KBE, die intrazelluläre Bakterien darstellt, die sich der Immunantwort des Wirts entzogen und sich erfolgreich in den infizierten Makrophagen repliziert haben.

Kippen Sie zum Ernten die Schale leicht und entfernen Sie vorsichtig mit einer Pipette das gesamte Medium aus der Vertiefung. Geben Sie 0,5 Milliliter destilliertes steriles Wasser in die Vertiefung. Übertragen Sie das resultierende Wasserlysat nach 30 Sekunden in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und wirbeln Sie es 10 Sekunden lang kräftig

auf.

Fügen Sie 4,5 Mikroliter und 50 Mikroliter des Wasserlysats zu 450 Mikrolitern destilliertem sterilem Wasser hinzu, um die 10-fachen und 100-fachen Verdünnungen vorzubereiten. Kurz vortexen, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. 50 Mikroliter der ursprünglichen 10-fach verdünnten und 100-fach verdünnten Proben werden auf Lysogenie-Bouillon-Agarplatten gegeben und mit einem Plattenspreizer verteilt.

Um auf emergentes Lm zu bestimmen, extrahieren Sie 10 Mikroliter des überlagernden Mediums aus der Schale und teilen Sie es in zwei 5-Mikroliter-Aliquots in Mikrozentrifugenröhrchen auf. Zu einem Aliquot werden 5 Mikroliter DMEM/FCS und 5 Mikroliter DMEM/FCS mit 5 Mikrolitern Gentamicin pro Milliliter zu dem zweiten Aliquot als Kontrolle gegeben.

Warten Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie 90 Mikroliter destilliertes steriles Wasser zu jedem Aliquot und wirbeln Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang kräftig ein. Geben Sie dann 50 Mikroliter der Probe auf LB-Agarplatten und verteilen Sie sie mit einem Plattenspreizer. Lagern Sie die Platten zwei Tage lang in einem 37-Grad-Inkubator, bevor Sie die Lm-Kolonien zählen.