Durchflusszytometrische Analyse von intrazellulären und emergenten extrazellulären Listeria monocytogenes in vitro

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte, die eine Makrophagenkultur enthält. Infizieren Sie mit fluoreszierenden Protein-exprimierenden Listeria monocytogenes, Lm.

Proteine auf Lm binden an spezifische Makrophagenrezeptoren und internalisieren die Bakterien in einem Phagosom. Darüber hinaus sezerniert Lm porenbildende Toxine, die die Phagosomenmembran stören und Bakterien in das Zytosol freisetzen, wo sie sich replizieren und von Aktinfilamenten des Wirts umgeben werden.

Die Aktin-Assemblierung-induzierenden ActA-Proteine auf Lm induzieren eine kontinuierliche Aktinpolymerisation am hinteren Ende des Bakteriums. Der erzeugte Aktin-Kometenschweif treibt Lm durch das Zytosol und dringt in die Makrophagenzellmembran ein, wobei polymerisiertes, mit Aktin umhülltes Lm in das Medium freigesetzt wird.

Sammeln und fixieren Sie nach der Inkubation das extrazelluläre, aktingebundene, Lm-haltige Medium aus einer Reihe von Vertiefungen. Fixieren Sie den Lm mit Paraformaldehyd. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, wodurch die Makrophagen aufgebrochen und das intrazelluläre Lm. Sammeln Sie das intrazelluläre Lm und fixieren Sie die Probe mit Paraformaldehyd.

Ersetzen Sie in anderen Vertiefungen das Medium durch zellundurchlässiges, gentamicinhaltiges Medium, um extrazelluläres Lm. Durch frische Medien ersetzen und für die gewünschte Zeit inkubieren.

Sammeln Sie nach der Inkubation das extrazelluläre Lm-haltige Medium und fixieren Sie die Probe mit Paraformaldehyd. Verwenden Sie destilliertes Wasser, um Lysat zu erhalten, das intrazelluläres Lm enthält, und fixieren Sie die Probe mit Paraformaldehyd. Fügen Sie den Proben fluoreszenzmarkiertes Phalloidin hinzu, das selektiv an polymerisiertes Aktin bindet.

Visualisieren Sie mit einem Durchflusszytometer die Fluoreszenzsignale von Lm und Aktin-bindendem Phalloidin in den Proben. Quantifizieren Sie das extrazelluläre und intrazelluläre Aktin-gebundene Lm, das aus den infizierten Makrophagen stammt.

Stellen Sie die vorbereiteten RAW 264.7-Zellen mit einem automatischen Zellzähler auf eine Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen pro Milliliter ein. Geben Sie 1 Milliliter der Probe in die Vertiefungen einer 6-Well-Gewebekulturplatte. Infizieren Sie die Zellen mit vorbereitetem Lm-Inokulum, das einer Infektionsmultiplizität von 50 entspricht.

1,5 Stunden nach der Infektion wird in einem 1,5-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 500 Mikrolitern 4 % PFA gefüllt ist, das Medium aus dem ersten Satz von Vertiefungen entnommen und das Röhrchen auf Eis gelegt. Um intrazelluläres Lm-Material zu sammeln, geben Sie 1 Milliliter destilliertes steriles Wasser in jede Vertiefung. Nach 60 Sekunden wird das resultierende Wasserlysat in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern 4 % PFA überführt. Wirbeln Sie das Rohr 10 Sekunden lang kräftig vor und legen Sie es auf Eis.

Entfernen Sie bei den verbleibenden Vertiefungen das Medium und ersetzen Sie es durch 1 Milliliter DMEM/FCS durch 5 Mikrogramm Gentamicin pro Milliliter, um extrazelluläres Lm abzutöten. Bringen Sie die Schale umgehend wieder in den Inkubator.

Entfernen Sie nach 30 Minuten das Medium und ersetzen Sie es durch DMEM/FCS ohne Gentamicin. Nach weiteren zwei und vier Stunden sammeln Sie die Medien in den Lysaten für den zweiten und dritten Zeitpunkt in den Röhrchen und legen sie zum Abkühlen auf das Eis. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 g für 7 Minuten.

Entfernen Sie mit einer Pipette den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Geben Sie einen Färbecocktail mit 50 Mikrolitern 4 % PFA und 15 Mikrolitern Phalloidin in das Röhrchen und mischen Sie, um jedes Pellet zu resuspendieren. Inkubieren Sie die Röhrchen im Dunkeln bei 4 Grad Celsius für 20 Minuten.

Geben Sie nach der Inkubation 1 Milliliter FACS-Puffer in jedes Röhrchen und pipettieren Sie zum Mischen auf und ab. Röhrchen in der Zentrifuge bei 10.000 mal g für 7 Minuten drehen. Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören.

Für den sofortigen Gebrauch suspendieren Sie jedes Pellet in 400 Mikrolitern FACS-Puffer. Bei Lagerung für eine spätere Analyse 200 Mikroliter FACS-Puffer und 200 Mikroliter 4 % PFA in das Röhrchen geben und suspendieren.