Warum ist die Bestimmung der koloniebildenden Einheiten für die Zielvalidierung entscheidend?

Die Quantifizierung koloniebildender Einheiten liefert einen direkten, funktionellen Nachweis der bakteriellen Eliminierung und ermöglicht die Beurteilung, ob ein Zielmolekül oder eine Verbindung die immunvermittelte Pathogenbeseitigung verbessert. Diese Messung unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung, indem sie eine Verbindung zwischen der Modulation eines Zielmoleküls und einem quantifizierbaren phänotypischen Ergebnis in vivo herstellt.

Wie verbessert eine serielle Verdünnung die Genauigkeit der Bestimmung der Bakterienlast?

Die serielle Verdünnung stellt sicher, dass die Kolonien einzeln und zählbar bleiben, und verhindert eine Überwucherung, die eine genaue Zählung erschweren könnte. Diese Methode ermöglicht eine präzise Berechnung der lebensfähigen Bakterien pro Milliliter Homogenat über verschiedene experimentelle Zeitpunkte hinweg.

Welche quantitativen Messungen ermöglichen den Vergleich der immunologischen Wirksamkeit unter verschiedenen Bedingungen?

Die Koloniezahlen aus Verdünnungen, die 30–300 Kolonien ergeben, ermöglichen die Berechnung der koloniebildenden Einheiten pro Milliliter und liefern so eine standardisierte Metrik zum Vergleich der bakteriellen Belastung zwischen Gruppen. Diese Werte unterstützen die statistische Analyse von Ausscheidungsraten und Interventionseffekten.

Warum sind Replikationsanforderungen für die Zusammenarbeit über Fachbereiche hinweg unerlässlich?

Die Replikation stellt sicher, dass beobachtete Unterschiede in der bakteriellen Belastung konsistent sind und nicht auf technische Variabilität zurückgehen, wodurch das Vertrauen in die gemeinsam genutzten Daten zwischen Entdeckungs-, Screening- und präklinischen Teams gestärkt wird. Standardisierte Replikation unterstützt den Assay-Transfer und die vergleichende Analyse zwischen verschiedenen Laboren.

Welche statistischen Analysefähigkeiten sind erforderlich, bevor dieser Assay durchgeführt wird?

Für den Assay sind grundlegende statistische Werkzeuge erforderlich, um die mittleren koloniebildenden Einheiten unter verschiedenen Bedingungen mithilfe von t-Tests oder ANOVA zu vergleichen und die Signifikanz von Unterschieden bei der Eliminierung zu bestimmen. Die Daten müssen normalverteilt sein oder entsprechend transformiert werden, um gültige Schlussfolgerungen zu ermöglichen.

Messung der bakteriellen Belastung von E. coli in Drosophila melanogaster nach einer E. coli-Infektion

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologie

0 Ansichten • 3:40 Min. • July 8th, 2025

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Beginnen Sie mit adulten Drosophila melanogaster-Fliegen, die mit E. coli injiziert wurden. Zu den gewünschten Zeitpunkten nach der Injektion werden anästhesierte Fliegen in separate Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis übertragen, um ihre Stoffwechselaktivität zu reduzieren.

Fügen Sie Puffer hinzu und homogenisieren Sie die Fliegen, indem Sie das Gewebe aufspalten und E. coli und endogene Darmmikrobiota freisetzen.

Jedes E. coli-haltige Fliegenhomogenat wird in Multi-Well-Plattenvertiefungen überführt. Füllen Sie die restlichen Vertiefungen mit Puffer. Führen Sie eine serielle Verdünnung des E. coli-haltigen Homogenats durch.

Die verdünnte Homogenatsuspension aus jeder Vertiefung wird ab der niedrigsten Verdünnung als einzelne Punkte auf einer Nähragarplatte abgegeben. Lassen Sie die Flecken in den Agar einziehen. Inkubieren Sie die Platte über Nacht, um die Vermehrung von E. coli zu ermöglichen und sichtbare Kolonien zu bilden. Die Inkubationsdauer ist entscheidend, um die Bildung der endogenen Darmmikrobiota-Kolonien der Fliege zu verhindern.

Zählen Sie die E. coli-Kolonien für jede Fliege aus den Verdünnungen mit zählbaren, nicht überlappenden Kolonien. Berechnen Sie die koloniebildende Einheit – die lebensfähige Bakterienlast – im Ausgangshomogenat zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion.

Eine im Laufe der Zeit verringerte E. coli-Belastung deutet auf eine bakterielle Beseitigung durch das Immunsystem der Fliege hin.

Legen Sie eine Untergruppe der infizierten Fliegen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Geben Sie 250 Mikroliter PBS in jedes Röhrchen und verwenden Sie einen Stößel, um die Fliegen zu homogenisieren. Als nächstes wird das Homogenat mit einem Spiralplattenteller auf eine LB-Agarplatte aufgetragen

Um das Homogenat durch serielle Verdünnung zu plattieren, übertragen Sie jedes Fliegenhomogenat in die erste Reihe einer 96-Well-Platte und füllen Sie jede Well der verbleibenden Reihen mit 90 Mikrolitern PBS. Entnehmen Sie mit einer Mehrkanalpipette 10 Mikroliter aus der ersten Reihe mit Fliegenhomogenat und geben Sie das Homogenat in die zweite Reihe.

Pipettieren Sie mindestens 10 Mal auf und ab, um das Homogenat gründlich zu mischen, dann nehmen Sie 10 Mikroliter des Homogenats und übertragen Sie es in die nächste Reihe. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den verbleibenden Zeilen. Beginnen Sie in der unteren Reihe, entnehmen Sie mit der Mehrkanalpipette 10 Mikroliter aus jeder Vertiefung und geben Sie sie auf eine LB-Platte.

Stellen Sie sicher, dass die Proben als diskrete Spots ausgegeben werden, die sich nicht berühren. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Vertiefungen aus jeder Reihe beprobt wurden, und geben Sie sie in absteigender Reihenfolge der Verdünnung auf die LB-Platte. Unabhängig davon, welche Beschichtungsmethode verwendet wird, achten Sie darauf, dass die Platten nicht überwuchern, damit die Kolonien klein und diskret bleiben.

Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator, sobald die experimentellen Bakterien sichtbare Kolonien gebildet haben, aber bevor Kolonien aus der Darmmikrobiota von Drosophila etwa 24 Stunden später sichtbar werden.

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Zuletzt aktualisiert: 15 August 2026

Messung der bakteriellen Belastung von E. coli in Drosophila melanogaster nach einer E. coli-Infektion

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