Nachweis der Inflammasomaktivierung mittels Fluoreszenzmikroskopie

Um die Inflammasomaktivierung des NOD-ähnlichen Rezeptors P3 oder NLRP3 nachzuweisen, nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit aktivierten Makrophagen, die NLRP3-Proteine exprimieren.

Behandeln Sie die Zellen mit Medien, die Ionophore und Glycin enthalten. Ionophore induzieren den Kaliumionenausfluss und aktivieren und oligomerisieren NLRP3-Proteine. Oligomerisiertes NLRP3 rekrutiert Adapterproteine, die die Bindung von Pro-Caspase-1 erleichtern und den NLRP3-Inflammasom-Komplex bilden.

Auf dem Inflammasom löst die Nähe die Pro-Caspase-1-Autospaltung aus, wodurch aktive Caspasen freigesetzt werden, die Pyroptose und Kernkondensation auslösen. Darüber hinaus stabilisiert Glycin die Zellstruktur und verhindert so die Zelllyse.

Makrophagen werden mit fluoreszierenden Reportersonden behandelt, die eine Caspase-1-Bindungsgruppe und ein Fluorophor enthalten, das über eine Aminosäuresequenz gebunden ist. Die aktivierte Caspase-1 erkennt die Aminosäuresequenz der Sonde und bindet an ihre Caspase-Bindungsgruppe, was ihre Visualisierung ermöglicht.

Fixieren Sie die Zellen und überziehen Sie sie mit Fluoreszenzfarbstoff, um die Zellkerne zu färben. Bild unter dem Fluoreszenzmikroskop.

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