Nachweis der Inflammasomaktivierung mittels Fluoreszenzmikroskopie

Um die Inflammasomaktivierung des NOD-ähnlichen Rezeptors P3 oder NLRP3 nachzuweisen, nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit aktivierten Makrophagen, die NLRP3-Proteine exprimieren.

Behandeln Sie die Zellen mit Medien, die Ionophore und Glycin enthalten. Ionophore induzieren den Kaliumionenausfluss und aktivieren und oligomerisieren NLRP3-Proteine. Oligomerisiertes NLRP3 rekrutiert Adapterproteine, die die Bindung von Pro-Caspase-1 erleichtern und den NLRP3-Inflammasom-Komplex bilden.

Auf dem Inflammasom löst die Nähe die Pro-Caspase-1-Autospaltung aus, wodurch aktive Caspasen freigesetzt werden, die Pyroptose und Kernkondensation auslösen. Darüber hinaus stabilisiert Glycin die Zellstruktur und verhindert so die Zelllyse.

Makrophagen werden mit fluoreszierenden Reportersonden behandelt, die eine Caspase-1-Bindungsgruppe und ein Fluorophor enthalten, das über eine Aminosäuresequenz gebunden ist. Die aktivierte Caspase-1 erkennt die Aminosäuresequenz der Sonde und bindet an ihre Caspase-Bindungsgruppe, was ihre Visualisierung ermöglicht.

Fixieren Sie die Zellen und überziehen Sie sie mit Fluoreszenzfarbstoff, um die Zellkerne zu färben. Bild unter dem Fluoreszenzmikroskop.

Zählen Sie Makrophagen mit blau kondensierten Kernen und grün fluoreszierenden Herden von aktivierter Caspase-1, was auf eine NLRP3-Inflammasom-Aktivierung hindeutet.

Beginnen Sie damit, das Medium durch LPS-geprimte Makrophagen aus dem Knochenmark zu ersetzen, die auf Glasdeckgläsern ausgesät wurden, durch 290 Mikroliter DMEM-5-Medium, ergänzt mit 5-mikromolarem Nigericin und 5-millimolarem Glycin pro Well. Stellen Sie die 24-Well-Platte für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Zellkultur-Inkubator zurück und fügen Sie nach den ersten 15 Minuten 10 Mikroliter 30X FAM-YVAD-FMK hinzu.

Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation dreimal 5 Minuten lang mit 1 Milliliter kaltem PBS pro Vertiefung und fixieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern 2% Paraformaldehyd pro Vertiefung für 30 Minuten auf lichtgeschütztem Eis und markieren Sie die Zellen in den letzten fünf Minuten mit einem geeigneten fluoreszierenden Kernfarbstoff.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal mit kaltem PBS, wie gerade gezeigt, und beladen Sie jeden Objektträger mit 7 Mikrolitern Anti-Fade-Eindeckmedium. Legen Sie ein Deckglas auf jeden Objektträger und lassen Sie das Eindeckmedium über Nacht aushärten, bevor Sie die Deckgläser mit Nagellack versiegeln.

Um die Zellen durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie abzubilden, legen Sie den unbehandelten Objektträger auf den Mikroskoptisch und fokussieren Sie manuell auf die Zellen. Passen Sie mithilfe der Einstellungen der Mikroskop-Nachschlagetabelle den Versatz an, bis in den unbehandelten Zellen kein positiver Sondenstand mehr beobachtet wird.

Suchen Sie als Nächstes unter Verwendung einer mit Nigericin behandelten Probe ein Feld, das Zellen enthält, die sowohl positiv als auch negativ für die Sondenfärbung sind, und stellen Sie die Bildgebungsebene des Sondenkanals auf die Ebene ein, die die höchste Intensität der positiven Färbung aufweist. Passen Sie dann die Verstärkung an, bis die Brennpunkte in den Zellen mit kondensierten Zellkernen sichtbar sind, und erhalten Sie Bilder von fünf zufällig ausgewählten Feldern pro Objektträger mit einer 100-fachen Gesamtvergrößerung.