Ein Laktat-Dehydrogenase-Freisetzungsassay zum Nachweis des Todes von Makrophagen nach Nigericin-Exposition

Nehmen Sie eine Testplatte mit Makrophagen, die mit Lipopolysaccharid geprimt sind.

Priming erhöht die Expression von inaktiven proinflammatorischen Zytokinvorläufern und NLRP3-Proteinen.

Fügen Sie Nigericin hinzu, ein Kaliumionophor, das den Ionenausfluss fördert. Dadurch wird der intrazelluläre Kaliumspiegel gestört und NLRP3-Proteine werden zu einem großen Komplex veranlasst.

Oligomerisiertes NLRP3 rekrutiert die Adapterproteine ASC und bewirkt deren Polymerisation. ASC-Filamente rekrutieren Pro-Caspase-1 und bilden NLRP3-Inflammasom, einen Multiproteinkomplex.

Pro-Caspase-1 erfährt eine Proximity-induzierte Autoaktivierung, bei der Caspase-1 entsteht. Caspase-1 spaltet das entzündungsfördernde Zytokin und das Gasdermin-D-Protein, wodurch eine Plasmamembranpore entsteht.

Dies führt zu einer Zytokinsekretion und einem entzündlichen programmierten Zelltod, Pyroptose, wobei intrazelluläre Inhalte, einschließlich Laktatdehydrogenase oder LDH, freigesetzt werden. Sammeln Sie den LDH-haltigen Überstand.

Fügen Sie eine Substratmischung hinzu – Laktat, Jodnitrotetrazoliumviolett oder INT-Farbstoff, NAD+ und Diaphorase. LDH oxidiert Laktat zu Pyruvat und reduziert gleichzeitig NAD+. Diaphorase katalysiert die Reduktion von INT und bildet rot gefärbtes Formazan.

Die Farbintensität entspricht der LDH-Freisetzung, wobei erhöhte Werte auf eine erhöhte Pyroptose-assoziierte Zellschädigung und den Tod hinweisen.

Um einen LDH-Freisetzungsassay durchzuführen, geben Sie 50 Mikroliter DMEM-5-Medium, ergänzt mit 10 mikromolarem Nigericin, in jede Versuchsvertiefung und 50 Mikroliter DMEM-5 in die spontanen und 100 % Lysekontrollvertiefungen für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Geben Sie nach 30 Minuten 10 Mikroliter 10x Lysepuffer in die 100%-Lysekontrollvertiefungen und geben Sie 10 Mikroliter Medium in die anderen Vertiefungen. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Platte und übertragen 50 Mikroliter Überstand aus jeder Vertiefung auf eine durchsichtige Platte mit flachem Boden.

Geben Sie anschließend 50 Mikroliter frisch aufgetautes und vorbereitetes Substrat für eine 30-minütige Inkubation im Dunkeln in jede Vertiefung und überprüfen Sie die Platte nach 15 Minuten, um sicherzustellen, dass das Signal die Nachweisgrenze des Plattenlesers nicht überschreitet. Am Ende der Inkubation geben Sie 50 Mikroliter Stopplösung in jede Vertiefung und messen Sie den OD₄₉₀ auf einem geeigneten Plattenlesegerät, um die Berechnung des prozentualen Anteils der Zelllyse pro Vertiefung zu ermöglichen.