Induktion und Visualisierung von extrazellulären Fallen von Neutrophilen in vormarkierten Neutrophilen

Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte mit fluoreszenzmarkierten Neutrophilen und behandeln Sie diese mit Patientenserum mit zytoplasmatischen Antikörpern gegen Neutrophile.

Diese Antikörper interagieren mit den Fc-Rezeptoren der Neutrophilen, aktivieren einen Signalweg, produzieren reaktive Sauerstoffspezies oder ROS und aktivieren die Peptidyl-Arginin-Deiminase.

ROS bewirkt die Degranulation von Neutrophilen, wodurch die Enzyme Elastase und Myeloperoxidase in das Zytoplasma freigesetzt werden. Diese Enzyme und aktivierte Peptidyl-Arginin-Deiminasen translozieren in den Zellkern.

Elastase spaltet Histan-H1, und Myeloperoxidase modifiziert Histone und leitet die Chromatin-Dekondensation ein. Aktivierte Peptidyl-Arginin-Deiminase induziert die Histon-Citrullinierung, wandelt Argininreste in Citrullin um und trägt zur weiteren Dekondensation bei.

Das dekondensierte Chromatin vermischt sich mit intrazellulären Proteinen, einschließlich antimikrobieller und zytoplasmatischer Proteine. Später zerfällt die Membran des Neutrophilen und setzt dekondensiertes Chromatin, das mit zytoplasmatischen Proteinen vermischt ist, in den extrazellulären Raum frei, wodurch eine extrazelluläre Falle für Neutrophile, NET, entsteht.

Fügen Sie einen zellundurchlässigen DNA-Farbstoff hinzu, der ausschließlich an extrazelluläre DNA in NETs bindet. Unter einem Fluoreszenzmikroskop erscheinen Neutrophile rot mit grünen extrazellulären netzartigen Strukturen, was die NET-Bildung bestätigt.

Stellen Sie eine Zellsuspension mit einer Dichte von 420.000 Zellen pro Milliliter in phenolrotfreiem RPMI-1640-Medium her, das 2 % FCS enthält. Geben Sie 37.500 Neutrophile in 90 Mikrolitern in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte mit flachem Boden.

Fügen Sie anschließend 10 Mikroliter des gewählten Stimulus in dreifacher Ausfertigung hinzu, um eine Konzentration von 10 % in jeder Vertiefung zu erreichen. Fügen Sie eine Negativkontrolle immer in dreifacher Ausfertigung hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln bei 37 Grad Celsius für die gewünschte Zeit, die von 30 Minuten bis 2, 4 oder 6 Stunden reicht. Bereiten Sie dann das Volumen des undurchlässigen DNA-Farbstoffs vor, das erforderlich ist, um 25 Mikroliter 5-mikromolaren undurchlässigen DNA-Farbstoff hinzuzufügen, um eine Endkonzentration von 1 Mikromolar in jeder Vertiefung zu erreichen.

15 Minuten vor Ende der Inkubationszeit 25 Mikroliter 5-mikromolaren undurchlässigen DNA-Farbstoff in jede Vertiefung geben. Setzen Sie die Inkubation für die letzten 15 Minuten bei 37 Grad Celsius im Dunkeln fort. Entfernen Sie danach den Überstand sehr vorsichtig und lagern Sie ihn bei Bedarf. Fügen Sie 100 Mikroliter 4% Paraformaldehyd hinzu. Bewahren Sie die Platte im Dunkeln auf und fahren Sie sofort mit dem nächsten Abschnitt fort.

Nachdem Sie die Einstellungen konfiguriert haben, wählen Sie Z Series aus. Wählen Sie 10 als Anzahl der Schritte aus. Wählen Sie 3 Mikrometer als Schrittweite. Legen Sie die Platte in das konfokale Immunfluoreszenzmikroskop ein.

Klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen. Geben Sie den Namen und die Beschreibung der Platte ein und wählen Sie den Lagerort aus. Wählen Sie die Bohrlöcher aus, die erworben werden müssen. Wählen Sie die Belichtungszeit für Texas Red und FitC, klicken Sie dann auf Capture Plate und starten Sie die Erfassung, die ca. 1 Stunde pro Platte dauert.

Wählen Sie anschließend Analysemakro aus. Wählen Sie dann W1 aus, und wählen Sie den Schwellenwert aus. Wählen Sie als Nächstes den gewünschten Pixelwert aus, und wählen Sie schließlich in einem zweiten ImageJ-Fenster W2 aus, und wählen Sie den Schwellenwert mit dem gewünschten Pixelwert aus. Wählen Sie ein Ziel für die Tabellenkalkulationsdatei aus. Führen Sie die Analyse aus, und speichern Sie anschließend die Protokolldatei.