Isolierung von Lipiden aus Neutrophilen aus menschlichem Blut durch biphasische Trennung

Nehmen Sie ein Glasröhrchen, das neutrophiles Homogenat mit freigesetzten intrazellulären Komponenten enthält.

Fügen Sie Methanol hinzu, ein polares Lösungsmittel, das die Lipid-Lipid- und Lipid-Protein-Wechselwirkungen stört. Die inhärente Polarität von Methanol verteilt die polaren Lipide gleichmäßig und löst sie auf. Fügen Sie als nächstes Chloroform hinzu, ein unpolares organisches Lösungsmittel, das mit unpolaren Lipiden interagiert, wodurch sie sich dispergieren und auflösen.

Zentrifugieren Sie, um das proteinhaltige Pellet von dem Überstand zu trennen, der Lipide, Polysaccharide und Zelltrümmer enthält. Den Überstand in ein frisches Glasröhrchen geben. Chloroform und destilliertes Wasser hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Probe.

Durch die spontane Wasserzugabe entsteht ein zweiphasiges System, das die Biomoleküle innerhalb der unteren Chloroform- und der oberen Wasser-Methanol-Schichten aufteilt.

Die Chloroformschicht besteht aus gelösten unpolaren Lipiden, während die obere Schicht nicht-lipidische Verunreinigungen und mehr polare Lipide enthält. Entfernen Sie die obere Wasser-Methanol-Schicht, ohne die lipidhaltige Schicht zu stören.

Verwenden Sie einen Vakuumkonzentrator, um das Lösungsmittel aus den Lipiden zu entfernen. Bis zur weiteren Verwendung bei niedrigeren Temperaturen lagern.

Um die Lipide aus den aus dem peripheren Blut des Menschen stammenden Neutrophilen zu isolieren, nehmen Sie die vorbereiteten Neutrophilen und legen Sie sie auf Eis. Pipettieren Sie die Neutrophilen in ein 15-Milliliter-Glasröhrchen mit Schraubverschluss und PTFE-Dichtung und homogenisieren Sie sie durch einminütiges Schütteln. Fügen Sie dann 2 Milliliter Methanol hinzu, eine Minute später folgt 1 Milliliter Chloroform. Nach einer weiteren Minute Schütteln drehen Sie die Glasröhren bei Raumtemperatur und 50 U/min für 30 Minuten.

Als nächstes pelletieren Sie die Proteinfraktion, indem Sie die Lösung 10 Minuten lang bei 7 Grad Celsius und 1952 mal g zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig in ein neues 15-Milliliter-Glas-Schraubverschlussröhrchen, wobei Sie das proteinhaltige Pellet zurücklassen. Lagern Sie das Pellet bei minus 20 Grad Celsius für eine spätere Quantifizierung.

Fügen Sie 1 Milliliter Chloroform hinzu und warten Sie eine Minute. Fügen Sie dann 1 Milliliter doppelt destilliertes Wasser hinzu und drehen Sie das Glas-Schraubverschlussröhrchen mit der Probe 30 Sekunden lang um. Nachdem Sie die Probe wie zuvor zentrifugiert haben, wird die obere Phase bis zur trüben Schicht, jedoch ohne Bezugnahme, entfernt und verworfen. Trocknen Sie die Proben in einem Vakuumkonzentrator bei 60 Grad Celsius und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius.