Ein durchlässiges Membraninsert-basiertes Infektionssystem zur Untersuchung der Auswirkungen bakterieller Toxine

0 views • 3:28 min • July 8th, 2025

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Nehmen wir ein Zweikammer-Infektionssystem, das durch einen durchlässigen Membraneinsatz getrennt ist. Das untere Kompartiment enthält anhaftende menschliche Keratinozyten oder Hautzellen.

Bakterielle Krankheitserreger in die obere Kammer geben und inkubieren. Die Membran verhindert den direkten Kontakt der Erreger mit den Keratinozyten. Krankheitserreger sezernieren Streptolysin S oder SLS – ein kleines Toxin –, das die Membran durchdringt, um die Zellen zu erreichen.

Der Natriumbicarbonat-Cotransporter auf Keratinozyten vermittelt den Einstrom von Bicarbonat- und Natriumionen und hält den intrazellulären pH-Wert aufrecht. SLS bindet an den Co-Transporter und unterbricht den Ionentransport, was zu intrazellulärem osmotischem Stress führt.

Die stressinduzierte nachgeschaltete Signalübertragung bewirkt eine Degradation des Inhibitors, der an den sequestrierten Kernfaktor-Kappa B oder NF-κB gebunden ist, was zu seiner Aktivierung führt. Das aktivierte NF-κB transloziert in den Zellkern, was zu einer Hochregulierung der proinflammatorischen Zytokinproduktion führt.

Bei der extrazellulären Sekretion binden die Zytokine an Todesrezeptoren auf der Wirtszelle und lösen so die Nekrose aus. Ernten Sie nach der Inkubation den Kulturüberstand, um die Auswirkungen des bakteriellen Toxins zu beurteilen.

Verwenden Sie unmittelbar vor der Behandlung 1X PBS, um die Zellen zu waschen. Tragen Sie dann 2 Milliliter frisches Wachstumsmedium mit oder ohne pharmakologische Behandlung auf die Sechs-Well-Platten oder 0,5 Milliliter Medium auf die Wells der 24-Well-Platten auf. Verwenden Sie anschließend unter einer Laminar-Flow-Haube eine sterile Pinzette, um vorsichtig einen sterilen 0,4-Mikron-durchlässigen Membraneinsatz in jede Vertiefung zu platzieren.

Ein schonender und steriler Umgang mit den durchlässigen Einsätzen während der Infektionsvorbereitung ist entscheidend, um zu verhindern, dass die Membran während dieses Prozesses beeinträchtigt oder kontaminiert wird.

Tragen Sie frisches Zellkulturmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die obere Kammer jeder Vertiefung auf. Tragen Sie dann ein geeignetes Volumen der normalisierten Bakterienkulturen auf die obere Kammer des permeablen Membraneinsatzsystems auf und tragen Sie Bakterienmedium auf die Kontrollvertiefungen auf.

Eine sorgfältige Zugabe der Bakterien in die obere Kammer sowie ein schonender Transport der infizierten Zellen zum Inkubator sind entscheidend, da es wichtig ist, dass Bakterien während des Versuchsaufbaus die untere Kammer nicht kontaminieren.

Um zu beurteilen, ob sezernierte Wirtsproteine vorhanden sind, verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den permeablen Membraneinsatz vorsichtig zu entfernen. Sammeln Sie dann, ohne die Monoschicht der Zellen zu stören, das Medium aus der unteren Kammer in 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 14.000 RCF und 4 Grad Celsius, um Zelltrümmer zu pelletieren. Entfernen Sie dann alle bis auf 50 Mikroliter des Überstands, geben Sie ihn in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius oder verwenden Sie ihn sofort.

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Last updated: 18 July 2026