Extraktion von Wirtszelllysat aus infizierten Wirtszellen, die in einem permeablen Membransystem kultiviert wurden
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 4:15 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie damit, Säugetier-Wirtszellen in das untere Kompartiment eines durchlässigen Membransystems zu säen.
Fügen Sie Streptokokken – ein pathogenes Bakterium, von dem bekannt ist, dass es Streptolysin-S- oder SLS-Toxin absondert, zum Membraneinsatz hinzu. Das SLS-Toxin diffundiert durch die Membranpore und gelangt in die Wirtszelle.
Die membrangebundenen Natrium-Bicarbonat-Cotransporter regulieren den Ionentransport und halten die zelluläre Homöostase aufrecht. Das Toxin bindet an diese Cotransporter, stört den Ionentransport und verursacht osmotischen Stress in den Wirtszellen.
Dadurch werden mehrere nachgeschaltete Signalkaskaden aktiviert, darunter p38 MAPK, ein Mitogen-aktivierter Proteinkinase-Signalweg. Aktiviertes p38 MAPK phosphoryliert seine nachgeschalteten Ziele und initiiert eine zelluläre Reaktion gegen die Bakterien.
Entfernen Sie anschließend die durchlässige Membraneinlage. Aspirieren Sie das Medium über den Wirtszellen. Fügen Sie Lysepuffer hinzu, um den zellulären Inhalt freizusetzen. Zentrifuge, um die Zelltrümmer zu pelletieren.
Sammeln Sie den Überstand, der lösliche Lysatkomponenten enthält, und das Pellet, das unlösliche Lysatkomponenten enthält. Bewahren Sie die Proben für die weitere Analyse auf.
Verwenden Sie unmittelbar vor der Behandlung 1X PBS, um die Zellen zu waschen. Tragen Sie dann 2 Milliliter frisches Wachstumsmedium mit oder ohne pharmakologische Behandlung auf die Sechs-Well-Platten oder 0,5 Milliliter Medium auf die Wells der 24-Well-Platten auf. Verwenden Sie anschließend eine sterile Pinzette unter einer Laminar-Flow-Haube, um vorsichtig einen sterilen 0,4 Mikrometer durchlässigen Membraneinsatz in jede Vertiefung zu platzieren.
Ein schonender und steriler Umgang mit den durchlässigen Einsätzen während der Infektionsvorbereitung ist entscheidend, um zu verhindern, dass die Membran während dieses Prozesses beeinträchtigt oder kontaminiert wird.
Tragen Sie frisches Zellkulturmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die obere Kammer jeder Vertiefung auf. Tragen Sie dann ein entsprechendes Volumen der normalisierten Bakterienkulturen auf die obere Kammer des permeablen Membraneinsatzsystems auf und tragen Sie Bakterienmedium auf die Kontrollvertiefungen auf.
Eine sorgfältige Zugabe der Bakterien in die obere Kammer sowie ein schonender Transport der infizierten Zellen zum Inkubator sind entscheidend, da es wichtig ist, dass Bakterien während des Versuchsaufbaus die untere Kammer nicht kontaminieren.
Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den durchlässigen Membraneinsatz vorsichtig zu entfernen.
Zur Beurteilung der Lysate der Wirtszelle wird das Medium sanft über der Monoschicht abgesaugt, ohne die Wirtszellen zu stören. Verwenden Sie dann PBS, um die Zellen einmal zu spülen. Aspirieren Sie das PBS vorsichtig und tragen Sie sofort ein Volumen eiskalten Lysepuffers auf, um beispielsweise eine Proteinkonzentration von 0,5 bis 1,5 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Inkubieren Sie die Proben dann 15 Minuten lang auf Eis.
Verwenden Sie anschließend einen Zellschaber, um die Zellen von der Plattenoberfläche jeder Vertiefung zu lösen, und übertragen Sie den gesamten Inhalt jeder Vertiefung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Proben dann 20 Minuten lang bei 14.000 RCF und 4 Grad Celsius.
Um lösliche Lysatkomponenten zu beurteilen, überführen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und lagern Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius oder verwenden Sie ihn sofort. Um nukleare oder andere unlösliche Lysatbestandteile zu beurteilen, bewahren Sie das Pellet auf und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius oder verwenden Sie es sofort.
Übersicht
Diese Studie untersucht die Wirkungen des Streptococcus-SLS-Toxins auf Säugetier-Wirtszellen, wobei der Fokus auf der Störung des Ionen-Transports und den darauffolgenden zellulären Reaktionen liegt. Die Methodik umfasst die Verwendung eines durchlässigen Membransystems, um die Interaktion zwischen den Bakterien und den Wirtszellen zu ermöglichen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Zellbiologie
- Signaltransduktion
Hintergrund
- Streptococcus sekretiert das Streptolysin-S-(SLS-)Toxin, das die Homöostase der Wirtszelle beeinträchtigt.
- Die Natrium-Bicarbonat-Cotransporter spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des Ionenhaushalts in Zellen.
- Die Störung des Ionentransports kann zu osmotischem Stress führen und Signalwege aktivieren.
- p38-MAPK ist ein zentraler Signalweg, der an der zellulären Stressantwort beteiligt ist.
Zweck der Studie
- Den Mechanismus verstehen, durch den das SLS-Toxin die Wirtszellfunktion beeinträchtigt.
- Die downstream-Effekte der p38-MAPK-Aktivierung als Reaktion auf eine bakterielle Infektion bewerten.
- Eine Methodik zur Analyse der Reaktionen von Wirtszellen auf bakterielle Toxine entwickeln.
Verwendete Methoden
- Ansiedlung von Säugetier-Wirtszellen in einem durchlässigen Membransystem.
- Aufbringung des SLS-Toxins auf den Membraneinsatz, um dessen Wirkung auf Wirtszellen zu untersuchen.
- Verwendung von Lysepuffer und Zentrifugation zur Isolierung zellulärer Bestandteile für die Analyse.
- Sorgfältige Handhabung der Proben, um Kontaminationen während des Experiments zu vermeiden.
Hauptergebnisse
- Das SLS-Toxin stört den Ionen-Transport, indem es an Natrium-Bicarbonat-Cotransporter bindet.
- Die Aktivierung von p38 MAPK führt zur Phosphorylierung nachgeschalteter Zielstrukturen.
- Zelluläre Reaktionen umfassen Veränderungen in der Zusammensetzung des Lysats und in Signalwegen.
- Die Methodik ermöglicht eine detaillierte Analyse der Wirtszellreaktionen auf bakterielle Toxine.
Schlussfolgerungen
- Die Studie liefert Einblicke in die Mechanismen der bakteriellen Pathogenese.
- Das Verständnis der p38 MAPK-Aktivierung kann therapeutische Strategien gegen Infektionen unterstützen.
- Der experimentelle Aufbau eignet sich effektiv zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dieses durchlässige Membransystem ermöglicht die kontrollierte Untersuchung bakterieller Toxinwirkungen auf Wirtszellen und unterstützt die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase. Durch die Isolierung der Toxinexposition bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung physiologischer Relevanz erhöht es das Vertrauen in die Zielvalidierung für antiinfektive Programme. Der Ansatz hilft dabei, therapeutische Kandidaten zu priorisieren, indem er wegfallspezifische Wirtsantworten klärt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die Aktivität bakterieller Toxine mit spezifischen Störungen des Wirtionsionentransports verknüpft wird.
- Wissenschaftlicher Wert: Klärt die Aktivierung von Signalwegen, wie beispielsweise der p38-MAPK-Signalübertragung, um mechanistische Zielstrukturen in Wirt-Pathogen-Interaktionen zu validieren.
- Operationaler Wert: Ermöglicht reproduzierbare Toxin-Expositions-Assays, die die biologische Variabilität in Workflows zur Zielvalidierung verringern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare Lysat-Fraktionen (lösliche und unlösliche Anteile) für die nachgeschaltete Analyse von Biomarkern oder Effektoren.
- Operativer Wert: Standardisiert die Vorbereitung der Wirtszellen und die Toxinexposition und verbessert so die Reproduzierbarkeit des Assays in verschiedenen Screening-Kampagnen.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine skalierbare Profilierung der Toxinantwort in Mehrfachbrunnenformaten zur Identifizierung von Leitverbindungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die Krankheitsrelevanz, indem natürliche Toxin-Wirt-Interaktionen modelliert werden, ohne dass die unteren Kompartimente direkt mit Bakterien kontaminiert werden.
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet frühe Mechanismen (Störung des Ionen Transports) mit phänotypischen Ergebnissen durch Analyse des Lysats und unterstützt so die Übereinstimmung translationaler Biomarker.
- Operativer Wert: Bietet eine wiederverwendbare Plattform zur kontinuierlichen Bewertung von Toxinvarianten oder inhibitorischen Wirkungen in präklinischen Kontexten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in die frühe Entdeckungsphase bis hin zu präklinischen Arbeitsabläufen, da sie hypothesengetriebene Studien zu Toxinwirkmechanismen ermöglicht, die Entscheidungen zur Optimierung von Wirkstoffkandidaten unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Risikominderung, indem toxispezifische Wirkungen auf die Signalübertragungskaskaden des Wirts isoliert werden.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Lysat-Auswertungen, die den Vergleich der Toxinpotenz oder der Wirksamkeit von Inhibitoren unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt lösliche und unlösliche Lysatfraktionen für Western Blot, ELISA oder Massenspektrometrie, um die Aktivierung von Signalwegen und zelluläre Stressreaktionen zu messen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Initiierungsevents (Störung des Ionen-Transports) mit zellulären Reaktionen und unterstützt so risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als modulares System, das an verschiedene Toxin-Wirt-Paare angepasst werden kann, wodurch die Notwendigkeit wiederholter Neuentwicklung von Assays verringert wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem unspezifische störende Faktoren in Toxinstudien reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Wirt-Toxin-Interaktionsassays über verschiedene Teams und Standorte hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem klarere Einblicke in die toxingesteuerten Wirtszelleffekte bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Anti-Toxin- oder wirtgerichteten Therapeutika basierend auf nachgewiesener Signalwegaktivierung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, steriler Technik und im Umgang mit Krankheitserregern unter Biosicherheitsbedingungen.
- Benötigt permeable Membraneinsätze mit validierter Porengröße und Verträglichkeit gegenüber nachfolgenden Lyse- und Zentrifugationsschritten.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Volumina der Lysepuffer, Zentrifugationsparametern und Probenspeicherungsprotokollen voraus.
- Die Anpassung an verschiedene Wirtszelltypen oder Toxinarten kann eine Optimierung der bakteriellen Multiplikation infektiöser Einheiten (MOI) und der Expositionszeit erfordern.
- Auf Toxine beschränkt, die in der Lage sind, die Membranporen zu durchdringen; nicht geeignet für große Makromoleküle oder intakte Bakterien.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026