Extraktion von Wirtszelllysat aus infizierten Wirtszellen, die in einem permeablen Membransystem kultiviert wurden

Beginnen Sie damit, Säugetier-Wirtszellen in das untere Kompartiment eines durchlässigen Membransystems zu säen.

Fügen Sie Streptokokken – ein pathogenes Bakterium, von dem bekannt ist, dass es Streptolysin-S- oder SLS-Toxin absondert, zum Membraneinsatz hinzu. Das SLS-Toxin diffundiert durch die Membranpore und gelangt in die Wirtszelle.

Die membrangebundenen Natrium-Bicarbonat-Cotransporter regulieren den Ionentransport und halten die zelluläre Homöostase aufrecht. Das Toxin bindet an diese Cotransporter, stört den Ionentransport und verursacht osmotischen Stress in den Wirtszellen.

Dadurch werden mehrere nachgeschaltete Signalkaskaden aktiviert, darunter p38 MAPK, ein Mitogen-aktivierter Proteinkinase-Signalweg. Aktiviertes p38 MAPK phosphoryliert seine nachgeschalteten Ziele und initiiert eine zelluläre Reaktion gegen die Bakterien.

Entfernen Sie anschließend die durchlässige Membraneinlage. Aspirieren Sie das Medium über den Wirtszellen. Fügen Sie Lysepuffer hinzu, um den zellulären Inhalt freizusetzen. Zentrifuge, um die Zelltrümmer zu pelletieren.

Sammeln Sie den Überstand, der lösliche Lysatkomponenten enthält, und das Pellet, das unlösliche Lysatkomponenten enthält. Bewahr