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Nehmen Sie eine Bildgebungskammer mit einer Kultur menschlicher Epithelzellen, die mit einem fluoreszierenden Indikator für intrazelluläres Kalzium beladen ist.
Fügen Sie ein Wachstumsmedium hinzu, das Kalziumionen enthält. Führen Sie Shigella, ein pathogenes Bakterium, ein und brüten Sie es aus.
Das bakterielle Sekretionssystem dringt in die Wirtszelle ein und setzt Invasionseffektoren frei. Die Invasion löst die Umlagerung von Aktinen aus und bildet eine Membran, die sich um die Bakterien herum kräuselt.
An der Invasionsstelle wird die Phospholipase C oder PLC auf der Plasmamembran aktiviert, und Inositoltriphosphat-Rezeptoren gruppieren sich auf dem endoplasmatischen Retikulum oder ER.
PLC hydrolysiert Membranphosphatidylinositol 4,5-bisphosphat zu Inositoltriphosphat oder IP3, das sich aufgrund des dichten Aktingeflechts lokal ansammelt.
IP3 bindet an Rezeptoren auf dem ER und bewirkt die Freisetzung von Kalzium. Kalziumindikatoren binden an freigesetzte Ionen und emittieren Fluoreszenz, die eine lokale Kalziumreaktion zeigt.
IP3 diffundiert langsam durch das Aktin, wodurch der ER-Kalziumspiegel weiter abgebaut und ein Kalziumkanal der Plasmamembran aktiviert wird, was zu einem Kalziumeinstrom führt.
Die Fluoreszenz in der gesamten Zelle deutet auf eine verzögerte globale Kalziumreaktion hin.
Legen Sie das Deckglas mit den Fluo-4-Zellen in eine Bildgebungskammer oder eine Glasbodenkammer. Verwenden Sie EM-Puffer, um die Probe dreimal zu waschen, um Verbindungen zu entfernen, die möglicherweise aus der Zelllyse resultieren. Fügen Sie dann einen Milliliter EM-Puffer hinzu. Stellen Sie die Kammer auf einen inversen Fluoreszenzmikroskoptisch, der auf 33 Grad Celsius erhitzt wird. Wählen Sie ein Mikroskopiefeld aus und richten Sie bei Bedarf Erfassungsparameter ein, einschließlich Belichtungszeit und Binning, um das Fluoreszenzsignal von Fluo-4 zu optimieren.
Um der Probe Bakterien hinzuzufügen, entfernen Sie vorsichtig 500 Mikroliter EM-Puffer aus der Kammer und fügen Sie 500 Mikroliter der Bakteriensuspension hinzu, um einen endgültigen OD600 von 0,05 zu erhalten. Führen Sie sofort eine Akquisition durch oder warten Sie 10 Minuten, damit sich die Bakterien auf den Zellen ansiedeln können. Am Ende des Erfassungsstroms wird ein Phasenkontrastbild des ausgewählten Feldes aufgenommen, um die Bakterien zu visualisieren, die mit den Zellen in Kontakt kommen, und die Membrankräuselungen, die mit den bakteriellen Invasionsstellen verbunden sind.
Wiederholen Sie den Aufnahmevorgang in Intervallen, die der Dauer der Bildaufnahmen, der Dateispeicherung und der Auswahl eines neuen Feldes entsprechen, um den gesamten Prozess abzudecken. Am Ende des Entnahmevorgangs wird der Probe zwei Mikromolare des Calciumionophors Ionomycin hinzugefügt, um die maximale Amplitude der Calciumsignale zu bestimmen. Nehmen Sie alle 3 bis 5 Sekunden Bilder auf, bis sich das Signal stabilisiert hat, in der Regel für weniger als 10 Minuten.
Anschließend wird der Calciumchelator EGTA bis zu einer Endkonzentration von 10 Millimolar zugegeben, um das Fluoreszenzsignal in Abwesenheit von Calcium zu bestimmen. Nehmen Sie alle 3 bis 5 Sekunden Bilder auf, bis das Signal stabilisiert ist, in der Regel für weniger als 10 Minuten. Führen Sie eine Bildanalyse gemäß dem Textprotokoll durch.