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Immunologie
0 Aufrufe • 3:00 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine Multiwell-Platte mit mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in ausgewählten Wells.
Einführung von Makrophagen und Inkubation, um die Interaktion zwischen MSC und Makrophagen in den Co-Kultur-Vertiefungen zu erleichtern.
Geben Sie Zymosan – eine Komponente der Hefezellwand – die an ein pH-empfindliches Fluorophor konjugiert ist, in alle Vertiefungen.
Makrophagen-Scavenger-Rezeptoren binden an Zymosan und lösen dessen Einlagerung in ein Phagosom aus, das mit einem Lysosom zu einem Phagolysosom verschmilzt.
Ein saurer pH-Wert im Inneren des Phagolysosoms bewirkt, dass das Fluorophor Fluoreszenz emittiert.
In den Co-Kultur-Wells projizieren MSCs tunnelnde Nanoröhren (TNT), zytoplasmatische Fortsätze, die eine Brücke zu Makrophagen schlagen. MSC-Mitochondrien wandern durch das TNT, um in die Makrophagen einzudringen, wodurch sich die Gesamtzahl der funktionellen Mitochondrien erhöht.
Eine erhöhte Anzahl der Mitochondrien erhöht die Produktion von Adenosintriphosphat oder ATP, was den Energiebedarf für eine Zunahme der Phagozytose anheizt.
Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität über die Zeit von den internalisierten Fluorophor-konjugierten Zymosanen auf.
Die Co-Kultur zeigt eine erhöhte Fluoreszenz im Vergleich zu Vertiefungen mit nur Makrophagen, was auf eine MSC-vermittelte Verstärkung der Makrophagen-Phagozytose hinweist.
Das Medium wird vorsichtig aus den Versuchsvertiefungen mit mesenchymalen Stammzellen abgesaugt. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Mikropipette, um 100 Mikroliter der behandelten und der Kontrollmakrophagen-Zellsuspensionen in die entsprechenden Versuchsvertiefungen entsprechend dem Plattendesign zu geben, und inkubieren Sie über Nacht, wie gezeigt. Geben Sie einen Milliliter Lebendzell-Bildgebungsmedium in das Fläschchen mit einem Milligramm Zymosan-Partikeln und sammeln Sie die Mediumpartikelmischung in einem Glaskulturröhrchen.
Nachdem Sie das Fläschchen mit einem zusätzlichen Milliliter Bildgebungslösung gespült haben, übertragen Sie das gespülte Bildgebungsmedium in das Glasröhrchen. Fügen Sie dann 3 Milliliter zusätzliche Bildgebungslösung hinzu, um eine Zymosanpartikelsuspension von 0,2 mg/ml zu erhalten. Wirbeln Sie die Zymosan-Suspension mit schnellen Impulsen 30 bis 60 Sekunden lang vortexen. Verwenden Sie dann einen Sonden-Ultraschallator, um die Suspension mit 60 schnellen Impulsen zu beschallen. Nach dem Aspirieren des Mediums werden die Versuchsvertiefungen in Reagenz-Blank-Wells mit 100 Mikrolitern Lebendzell-Imaging-Lösung gespült.
Aspirieren Sie anschließend die Bildgebungslösung für lebende Zellen aus den Vertiefungen und fügen Sie 100 Mikroliter der Zymosan-Suspension hinzu. Öffnen Sie das Plattenfach des Leuchtstofflesers über die Touchpad-Oberfläche. Legen Sie die Platte ohne Deckel in das Fach mit der Vertiefung A1 in der oberen linken Ecke. Schließen Sie das Fach mit dem Touchpad und klicken Sie auf die grüne Schaltfläche "Lesen" im oberen Menü.