JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Immunologie
0 Aufrufe • 4:41 Min. • July 8th, 2025
Bestimmte gramnegative bakterielle Krankheitserreger kontaktieren Wirtszellen und verwenden Sekretionssysteme, um Effektorproteine zu injizieren und so die Zellinvasion zu erleichtern.
Um Effektorproteine in vitro in Säugetierzellen zu bringen, pipettieren Sie Säugetierzellen in eine gekühlte Küvette. Fügen Sie Streptavidin-bindende Peptid-markierte bakterielle Effektorproteine hinzu und mischen Sie.
Führen Sie eine Elektroporation durch. Während des Laufs wird die Lipiddoppelschicht der Wirtszellmembran durch kurze elektrische Impulse gestört, um vorübergehende Poren zu bilden, die den zellulären Eintritt von Effektorproteinen erleichtern. Plattieren Sie die Zellen auf eine Glasplatte mit Medien, damit sich die Zellen erholen und an der Platte haften können. Die Poren verschließen sich wieder und schließen die Proteine darin ein.
Nach der Zellregeneration fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen für den Antikörperzugang zu intrazellulären Zielen. Inkubieren Sie mit einer proteinhaltigen Blockierungslösung, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern. Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die spezifisch an das Streptavidin-bindende Peptid-Tag auf den intrazellulären Eff
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