Ein Assay zur Untersuchung der Rolle von Vitronectin bei der bakteriellen Adhärenz an Epithelzellen des Wirts

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit adhärenten Epithelzell-Monoschichten. Ersetzen Sie Medien durch serumfreie Medien, um Interferenzen mit dem Serumprotein zu vermeiden. Nach der Inkubation Medien entfernen. Waschen Sie die Zellen mit Puffer. Fügen Sie gekühlte serumfreie Medien hinzu, die Vitronektin enthalten. Bei niedrigeren Temperaturen inkubieren.

Die N-terminale RGD-Domäne von Vitronektin bindet an die Integrinrezeptoren der Epithelzelloberfläche. Niedrigere Temperaturen hemmen die zelluläre Internalisierung des Vitronektin-Integrin-Komplexes.

Nach der Sättigung des Integrinrezeptors das Medium entfernen. Mit Puffer waschen, um überschüssiges Vitronektin zu entfernen, das die bakterielle Vitronectin-abhängige Integrinbindung beeinträchtigen könnte.

Fügen Sie Haemophilus influenzae Typ f oder Hif, einen gramnegativen bakteriellen Erreger, in Suspension hinzu. Ausbrüten.

Protein H auf der Hif-Oberfläche bindet an den C-Terminus des Vitronektins, was die Adhärenz der Hif an der Epithelzelle und die anschließende Internalisierung erleichtert.

Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es mit Puffer, um ungebundenes Hif zu entfernen. Verwenden Sie ein Zellablösungsenzym, um die Z