Ein humanes Zervixschleimhautinfektionsmodell zur Untersuchung der HIV-Pathogenese unter ex vivo-Bedingungen
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 4:51 Min. • July 8th, 2025
Legen Sie die Gebärmutterschleimhaut in eine Petrischale. Trennen Sie die Ektozervix- und Endozervix-Schleimhaut von der Submukosa. Schneiden Sie die Schleimhautschicht in kleinere Explantate und geben Sie diese in eine konische Röhre.
Geben Sie das humane Immundefizienzvirus Typ 1 oder HIV-1 in das Explantationsröhrchen. Die HIV-1-Viruspartikel nähern sich der freigelegten Schleimhautschicht und binden an den CD4-Rezeptor und den CXCR4-Co-Rezeptor auf der Wirtszelle.
Nach der Bindung verschmilzt die Virushülle mit der Wirtszellmembran und gibt ein virales Kapsid ab, das virale RNA und ein reverses Transkriptase-Enzym in das Zytoplasma enthält. Im Zytoplasma wandelt die reverse Transkriptase die virale RNA in komplementäre DNA oder cDNA um.
Die cDNA wandert in den Zellkern der Wirtszelle, wo die Integrase die virale DNA in das Wirtsgenom einbaut. Die virale DNA steuert die Synthese neuer viraler RNA und Proteine, die sich zu neuen Viruspartikeln zusammensetzen. Diese Partikel knospen von der Wirtszelle ab und erhalten eine Lipidhülle.
Spülen Sie die Explantate mit einem geeigneten Puffer ab, um ungebundene Viren zu entfernen. Zum Schluss die Explantate auf einen Gelatineschwamm in eine Multiwell-Platte mit geeignetem Medium geben und inkubieren.
Die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche maximiert die Sauerstoffexposition und die Zugänglichkeit der Nährstoffe durch die Schwammkapillaren und verbessert so die Modellierbarkeit für die nachgelagerte Analyse.
Verwenden Sie den Deckel der Petrischale als Schneidefläche, um das Gewebe zu präparieren. Halten Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette fest und trennen Sie die Schleimhaut des Ektozervix und/oder des Endozervix mit einem Skalpell und einer Klinge von der darunter liegenden Stroma und Submukosa, um Schleimhautstreifen zu erhalten. Schneide die Schleimhaut in 2 Millimeter breite Streifen. Entfernen und entsorgen Sie so viel Submukosa wie möglich, so dass nur eine 2 Millimeter dicke Gewebeschicht übrig bleibt. Schneiden Sie dann die Streifen in 2 Millimeter dicke Blöcke.
Übertragen Sie Gewebeexplantate in eine neue 100-Millimeter-Petrischale, die 10 bis 20 Milliliter CMT enthält, um eine Austrocknung des Gewebes während der Dissektion zu vermeiden. Schwenken Sie die Platte am Ende der Dissektion, um die Explantatverteilung zu randomisieren. Übertragen Sie die Explantate mit einer sterilen Pinzette in sterile konische 1,5-Milliliter-Röhrchen. Entfernen Sie das Medium im Röhrchen mit einer Pipette.
Um ein optimales Ergebnis zu erzielen, sollten Explantate des Gebärmutterhalses so schnell wie möglich nach der Operation bearbeitet und infiziert werden, idealerweise am Tag der Operation. Alternativ kann das Gewebe über Nacht bei 4 Grad in CMT getaucht gelagert und sofort nach der Dissektion infiziert werden.
Tauen Sie das HIV-1-Präparat in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Nach dem Auftauen das Virus in die Röhrchen mit den Explantaten übertragen. Übertragen Sie die Röhrchen in einen Thermoschüttler und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und wiegen Sie bei 300 U/min. Drehen Sie die Röhrchen einige Male vorsichtig alle 30 bis 60 Minuten um.
Füllen Sie in der Zwischenzeit eine Sechs-Well-Platte mit 3 bis 4 Millilitern steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Am Ende der Inkubation mit HIV-1 entsorgen Sie mit einer Pipette das gesamte Viruspräparat in den Röhrchen mit den Explantaten in einen Behälter mit Desinfektionslösung. Verwenden Sie dann eine Pinzette und eine Pipette, um die Explantate in die Sechs-Well-Platte mit PBS zu übertragen.
Nachdem Sie die Explantate eine Minute lang bei Raumtemperatur in PBS ruhen gelassen haben, waschen Sie sie, indem Sie das PBS zwei- bis dreimal vorsichtig auf und ab in die Vertiefung pipettieren. Entsorgen Sie dann das PBS mit einer Pipette in einen Behälter mit Desinfektionslösung. Geben Sie 3 bis 4 Milliliter neues PBS in jede Vertiefung. Wiederholen Sie dies noch zwei Mal für insgesamt drei Wäschen. Entsorgen Sie das PBS kurz vor dem Transfer der Explantate in die Schwämme, um eine Austrocknung des Gewebes zu vermeiden.
Übertragen Sie nun mit einer Pinzette fünf bis acht Explantate auf jedem Gelatineschwamm in eine 12-Well-Platte. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Untersuchung der HIV-1-Infektion in Explantaten der zervikalen Uterusschleimhaut beschrieben. Das Protokoll unterstreicht die Bedeutung der Aufrechterhaltung der Gewebeviabilität für nachgeschaltete Analysen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Virologie
- Infektionskrankheiten
- Zellbiologie
Hintergrund
- HIV-1 ist ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem.
- Das Verständnis seiner Infektionsmechanismen ist entscheidend für die Entwicklung therapeutischer Strategien.
- Die Zervixschleimhaut stellt einen wichtigen Ort für den Eintritt von HIV-1 dar.
- Explantatmodelle können Einblicke in die Wechselwirkungen des Virus mit Wirtsgeweben liefern.
Zweck der Studie
- Etablierung eines zuverlässigen Explantenmodells zur Untersuchung der HIV-1-Infektion.
- Untersuchung der Bindungs- und Eintrittsmechanismen von HIV-1 in zervikalem Gewebe.
- Verbesserung des Verständnisses der HIV-1-Pathogenese in Schleimhautgeweben.
Verwendete Methoden
- Isolierung der Ektocervix- und Endocervixschleimhaut vom Submukosa.
- Herstellung von Gewebe-Explantaten zur Virusinfektion.
- Infektion der Explantate mit HIV-1 und Inkubation unter kontrollierten Bedingungen.
- Waschen und Überführen der Explantate in ein geeignetes Medium zur Analyse.
Hauptergebnisse
- Eine erfolgreiche Infektion von zervikalen Explantaten mit HIV-1 wurde erreicht.
- Virale Eintrittsmechanismen wurden mittels Explantaten charakterisiert.
- Das Modell zeigte sich als lebensfähig für nachfolgende Analysen.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Wechselwirkungen von HIV-1 mit Schleimhautgeweben bei.
Schlussfolgerungen
- Das Explantatmodell eignet sich zur Untersuchung der HIV-1-Infektion in Zervixgeweben.
- Diese Methode kann zur Entwicklung therapeutischer Interventionen beitragen.
- Zukünftige Studien können auf diesem Modell aufbauen, um weitere Aspekte der HIV-1-Pathogenese zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dieses ex vivo-Modell der humanen Zervixschleimhaut ermöglicht die mechanistische Untersuchung des Eintrags von HIV-1 und der frühen Pathogenese an einer physiologisch relevanten Schleimhautbarriere. Durch die Erhaltung der Gewebearchitektur und zellulären Interaktionen unterstützt das System die Validierung von Zielstrukturen und die Risikominderung von Eintrittshemmstoffen oder Schleimhautimpfstoffen. Es stellt ein für den Menschen relevantes System bereit, um in vitro gewonnene Erkenntnisse mit der in vivo Wirksamkeit zu verknüpfen und Go/No-Go-Entscheidungen in antiviralen Wirkstoffentwicklungsprozessen zu unterstützen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die direkte Beobachtung der Bindung von HIV-1 an CD4- und CXCR4-Rezeptoren auf primären humanen Mukosazellen und validiert damit die Zielinteraktion.
- Operativer Wert: Verwendet eine Explantatpräparation, die die Gewebeviabilität erhält, um nachfolgende Analysen der viralen Replikation und der Wirtsantworten durchzuführen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die quantitative Beurteilung der viralen Eintritts- und Replikationskinetik unter kontrollierten Luft-Flüssig-Grenzflächenbedingungen.
- Operativer Wert: Standardisierte Wasch- und Transferschritte verringern die Variabilität und ermöglichen reproduzierbare Tests mit Wirkstoffen oder Antikörpern in Schleimhautgewebe.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert die pathogenetischen Vorgänge der HIV-1-Infektion an Schleimhäuten und ermöglicht die Bewertung von Wirkstoffkandidaten, die die virale Fusion, Reverse Transkription oder Integration in menschlichem Gewebe blockieren.
- Operativer Wert: Die Kultur von Gewebeproben auf Gelatineschwämmen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche erhält die Lebensfähigkeit der Exzisate und ermöglicht longitudinale Messungen für präklinische Wirksamkeitsstudien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Modell fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung ein und liefert Daten aus menschlichem Gewebe, um Kandidaten vor Tierversuchen zu priorisieren.
- Entdeckungsbiologie: Überprüft Hypothesen zu Eintragsmechanismen von HIV-1 und Abhängigkeiten von Wirtsfaktoren in primärem humanem Zervixschleimhautgewebe.
- Screening: Ermöglicht die Bewertung von Eintragsinhibitoren oder schleimhautgebundenen Immunogenen unter Verwendung eines quantifizierbaren viralen Outputs als Nachweisparameter.
- Analytik: Erzeugt Messwerte für virale RNA, Proteinexpression oder Freisetzung von Viruspartikeln, um Infektionsbedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet Befunde aus Schleimhaut-Explantaten mit präklinischen Modellen, indem die Relevanz von Zielstrukturen im humanen Gewebe validiert wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung anderer sexuell übertragbarer Erreger oder schleimhautgebundener Impfkandidaten.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Unschärfe bei der HIV-1-Infektion, indem physiologisch relevantes humanes Mukosagewebe verwendet wird.
- Operativer Wert: Standardisierte Protokolle zur Präparation und Inkubation von Explantaten unterstützen die Übertragbarkeit zwischen Laboren.
- Strategischer Wert: Unterstützt frühe Entscheidungen über die Weiterentwicklung von Substanzen, indem die Wirksamkeit von Einstiegsblockern an der Mukosa vorhergesagt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf Validierungsdaten aus humanem Gewebe.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit menschlichem Gewebe, in der Schleimhaut-Dissektion und in sterilen virologischen Techniken.
- Setzt den Zugang zu frischem Zervixgewebe, HIV-1-Stämmen und kontrollierter Inkubationsausrüstung (Thermoshaker, Inkubator) voraus.
- Erfordert standardisierte Arbeitsabläufe bei der Herstellung, dem Waschen und dem Transfer von Explantaten, um die Variabilität zu minimieren.
- Die Anpassung an andere Schleimhautgewebe könnte eine Optimierung der Dissektions- und Kulturbedingungen erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Variabilität zwischen Gewebespender:innen und die begrenzte Lebensdauer der Explantate, was deren zeitnahe Verwendung nach der Dissektion notwendig macht.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026