Eine Technik zur Etablierung eines bakteriellen Infektionsmodells in Insektenlarven

Legen Sie eine Larve von Galleria mellonella – der Großen Wachsmotte – auf eine Injektionsplattform und legen Sie die Bauchseite frei.

Nehmen Sie eine Mikrospritze, die eine Suspension von Mycobacterium bovis BCG lux enthält – einem lebenden bakteriellen Impfstoffstamm, der genetisch verändert wurde, um Biolumineszenz zu erzeugen. Injizieren Sie die Suspension in das letzte Bein oder die Bauchanhänge – wodurch Bakterien in die Hämolymphe freigesetzt werden – die Kreislaufflüssigkeit in der Körperhöhle.

Bringen Sie die Larve in eine kontrollierte Umgebung und brüten Sie sie aus. Die Bakterien nutzen die Hämolymphe als reichhaltige Nährstoffquelle und vermehren sich.

Hämozyten – wirbellose Immunzellen in der Hämolymphe – gruppieren sich um die Bakterien und bilden eine granulomähnliche Struktur, um die Ausbreitung der Infektion zu verhindern. Die Hämozyten setzen Pro-Phenoloxidase frei, die proteolytisch gespalten wird, um Phenoloxidase zu bilden.

Phenoloxidase synthetisiert Melanin, das die Bakterien an der Infektionsstelle bindet. Die Ablagerung von Melaninpigmenten führt zu einer systemischen Melanisierung, die die Larvenfarbe verdunkelt.

Die Hämozyten hüllen die Bakterien in Phagosomen ein. Die Phagosomen verschmelzen mit Lysosomen, um lytische Enzyme zu erhalten, was zu einem bakteriellen Abbau führt. Eine Untergruppe von Bakterien kann sich dem phagolysosomalen Abbau entziehen und sich in Hämozyten ansiedeln – was zu einer anhaltenden Infektion führt.

Messen Sie die bakterielle Biolumineszenz in definierten Intervallen. Ein anfänglicher Rückgang der Biolumineszenz deutet auf eine wirksame antibakterielle Reaktion hin, während ein Plateau des Wertes auf eine anhaltende Infektion hinweist.

Bewahren Sie die gekauften Larven im Dunkeln bei 18 Grad Celsius bei der Ankunft auf und verwenden Sie sie innerhalb einer Woche nach dem Kauf. Identifizieren und selektieren Sie gesunde Larven für Experimente auf der Grundlage einer einheitlichen cremefarbenen Farbe, einer angemessenen Größe und eines angemessenen Gewichts, einer hohen Beweglichkeit und der Fähigkeit, sich beim Umdrehen aufzurichten. Zählen Sie die gesunden Larven mit einer Pinzette vorsichtig in eine Petrischale, die mit einer Schicht Filterpapier ausgelegt ist, und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Bereiten Sie die Injektionsplattform vor, indem Sie ein kreisförmiges Filterpapier mit einem Durchmesser von 94 Millimetern auf eine flache, erhabene Oberfläche kleben. Aspirieren Sie drei Volumen 70 % Ethanol in eine 25-Mikroliter-Mikrospritze, um sie zu sterilisieren, zu verwerfen und mit drei Volumen sterilem PBST weiter zu spülen. Dann resuspendieren Sie das vorbereitete BCG lux-Inokulum und aspirieren Sie 10 Mikroliter in die sterilisierte Mikrospritze. Verwenden Sie eine separate Spritze, um PBST für eine Negativkontrolle zu aspirieren.

Nach 10 Injektionen resuspendieren Sie das BCG lux-Inokulum, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten. Nehmen Sie mit einer Pinzette eine Larve auf und legen Sie sie auf die Injektionsplattform. Drehen Sie die Larve auf der Plattform auf den Rücken und fixieren Sie sie, indem Sie Kopf und Schwanz mit der Pinzette sichern. Lokalisieren Sie den letzten linken Proleg, der vom Kopf der Larve herunterzählt, und führen Sie die Spitze der Nadel vorsichtig 5 bis 6 mm tief in einem Winkel von 10 bis 20 Grad zur horizontalen Ebene ein. Injizieren Sie das Inokulum aus der Spritze.

Setzen Sie die infizierte Larve nach jeder Infektion in eine Petrischale um, die mit einer Schicht Filterpapier ausgelegt ist. Eine einzige 94-Millimeter-Petrischale kann bis zu 30 Larven aufnehmen. Lagern Sie die Petrischale in einer belüfteten, dunklen Box in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Überwachen Sie das Überleben der Larven alle 24 Stunden. Larven gelten als tot, wenn sie sich als Reaktion auf Berührung nicht bewegen. Erfassen Sie das Überleben und beurteilen Sie die statistische Signifikanz mit einem Mantel-Cox-Test.