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Um die Infiltration von Immunzellen in uropathogenem, mit E. coli infiziertem Mausblasengewebe zu quantifizieren, legen Sie das zerkleinerte Gewebe in einen Verdauungspuffer, der Kollagenase und Desoxyribonuklease enthält.
Inkubieren Sie unter regelmäßigem Schütteln, um das Gewebe zu stören.
Kollagenase verdaut die extrazelluläre Matrix des Gewebes und setzt Zellen frei. Desoxyribonuklease baut störende freie DNA ab.
Nach der Inkubation einen Puffer mit einem Chelatbildner und fötalem Rinderserum hinzufügen, um die Verdauungsenzyme zu inaktivieren.
Die verdaute Mischung wird durch ein Sieb geleitet, um Gewebereste und Bindegewebe zu entfernen und eine einzellige Suspension zu erhalten.
Zentrifugieren und resuspendieren Sie die Zellen in einem Puffer, der Fc-blockierende Antikörper enthält. Diese Antikörper binden an Fc-Rezeptoren von Immunzellen, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.
Fügen Sie Fluorophor-markierte Anti-CD45-Antikörper hinzu, die an das Transmembran-CD45-Protein auf Immunzellen binden.
Zentrifugieren Sie die resuspendierten Zellen und leiten Sie sie durch ein Zellsieb, um Zellaggregate zu entfernen.
Messen Sie mit einem Durchflusszytometer die Fluoreszenzsignale von den Fluorophor-konjugierten Antikörpern auf Immunzellen, um die Infiltration von Immunzellen in der Blase zu quantifizieren.
Um die Durchflusszytometrie am Blasengewebe durchzuführen, verwenden Sie nach der Isolierung der Blase wie gezeigt eine Schere, um das Gewebe gut zu zerkleinern. Fügen Sie 1 gehackte Blase pro Röhrchen mit Verdauungspuffer hinzu, schütteln Sie dann das Röhrchen, um das gehackte Gewebe im Verdauungspuffer zu waschen, und halten Sie es auf Eis, bis alle Blasen präpariert und zerkleinert sind. Inkubieren Sie die gehackte Blase bei 37 Grad Celsius für 60 bis 75 Minuten und schütteln Sie sie alle 15 Minuten 5 Sekunden lang kräftig mit der Hand.
Wenn das Gewebe ein glasiges, transparentes Aussehen hat, das an nasses Seidenpapier erinnert, ist die Verdauung abgeschlossen. Inaktivieren Sie die Verdauungsenzyme durch Zugabe von 2 bis 3 Millilitern eiskaltem Durchflusszytometrie-Puffer und mischen Sie vorsichtig. Legen Sie dann die Röhren auf Eis.
Um eine einzellige Suspension zu gewährleisten und jegliches Bindegewebe zu entfernen, wird der Inhalt des Röhrchens durch einen 100-Mikrometer-Filter geleitet, der in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen platziert ist. Drücken Sie dann mit dem Ende eines Spritzenkolbens vorsichtig das restliche Gewebe durch den Filter. Waschen Sie den Filter mit zusätzlichen 2 Millilitern Durchflusszytometrie-Puffer und bewahren Sie die Proben auf Eis auf. Waschen Sie dann die Proben durch Zentrifugation bei 200 mal g bei 4 Grad Celsius für 7 Minuten.
Resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Durchflusszytometriepuffer, der den auf 5 Mikrogramm pro Milliliter verdünnten Fc-Block enthält, und geben Sie es auf eine 96-Well-Platte mit rundem Boden. Nach 10 bis 15 Minuten geben Sie 100 Mikroliter des gewünschten Antikörpercocktails in jede Probe. Inkubieren Sie die Proben dann 30 bis 45 Minuten lang auf lichtgeschütztem Eis. Waschen Sie die Proben durch Zentrifugation bei 200 mal g bei 4 Grad Celsius für 7 Minuten.
Zum Schluss resuspendieren Sie die Zellpellets in 200 Mikrolitern Durchflusszytometriepuffer und leiten Sie die Proben durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb auf einem 5-Milliliter-Polystyrolröhrchen, kurz bevor Sie an einem Durchflusszytometer entnommen werden.