JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 2:33 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine menschliche Darm-Organoid-Kultur. Die Organoide bestehen aus Epithelzellen, die dem zentralen Lumen zugewandt sind und die In-vivo-Architektur nachahmen.
Nehmen Sie einen Mikroinjektor, der halbmondförmige Sporozoiten – die infektiöse Form – von Cryptosporidium parvum, einem Parasiten, enthält.
Injizieren Sie Sporozoiten in das Organoid-Lumen
.Parasitenlektine binden an bestimmte Kohlenhydrate auf Epithelzellen und erleichtern so deren Eintritt in eine parasitophore Vakuole.
Der internalisierte Parasit verwandelt sich in einen Trophozoiten – das Fressstadium –, das Nährstoffe erhält und sich asexuell fortpflanzt, um Typ-I-Meront zu bilden, das Merozoiten enthält – die invasive Form.
Freigesetzte Merozoiten infizieren benachbarte Epithelzellen und entwickeln Typ-II-Meronten, die Merozoiten enthalten.
Die Merozoiten dringen in benachbarte Zellen ein und differenzieren sich entweder in Mikrogamont oder Makrogamont – männliche und weibliche Fortpflanzungsstadien.
Das Mikrogamont durchläuft eine Teilung zu Mikrogameten, die außerhalb der Vakuole freigesetzt werden.
Eine Mikrogamete befruchtet das Makrogamont und erzeugt eine Zygote.
Die Zygote teilt sich und bildet eine sporozoithaltige Oozyste. Nach der Freisetzung wiederholen die Sporozoiten den Infektionszyklus.
Ernten Sie die Organoide, um den Fortschritt der Infektion zu beurteilen.
Um die Parasiten in die apikale Seite eines 3D-Organoids zu mikroinjizieren, verwenden Sie zunächst einen Mikropipettenzieher, um Glasinjektionskapillaren vorzubereiten. Schneiden Sie die Spitze der Kapillare mit einer Pinzette auf einen Durchmesser von 9 bis 12 Mikrometern ab, um einen einfachen Fluss von Sporozoiten oder Oozysten zu ermöglichen, wenn Sie sich dafür entscheiden, Oozysten direkt zu injizieren, und verwenden Sie Mikroladerspitzen, um jede Kapillare mit einer schnellen, grünen, mit Farbstoff markierten Oozysten- oder Sporozoitensuspension zu füllen.
Laden Sie dann die erste mit Sporozoit gefüllte Kapillare in einen Mikroinjektor und verwenden Sie ein inverses Mikroskop mit einer 5-fachen Vergrößerung und konstantem Druck, um 100 bis 200 Nanoliter der Suspension in jedes Organoid zu mikroinjizieren.