Ein in vitro rekombinantes Virusreportersystem zum Nachweis von Virusinfektionen
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 3:56 Min. • July 8th, 2025
Nehmen wir eine menschliche Leberkrebs-Zellkultur, die genetisch so verändert wurde, dass sie Natriumtaurocholat exprimiert, das Polypeptid oder NTCP mittransportiert – einen Transmembranrezeptor.
Fügen Sie das rekombinante Hepatitis-B-Virus oder HBV hinzu. Das Virus besteht aus einer äußeren Hülle, die Oberflächenproteine enthält, und einem inneren Nukleokapsid, das das Genom umschließt. Die Einfügung eines Luciferase-Reportergens hemmt die Fortpflanzungsfähigkeit des Virus.
Das virale Hüllprotein bindet an den NTCP-Rezeptor der Wirtszelle.
NTCP interagiert mit dem epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor EGFR und oligomerisiert, wodurch eine EGFR-vermittelte Endozytose des Virus induziert wird.
Die Virushülle verschmilzt mit der Endosomenmembran, um das Nukleokapsid freizusetzen, das sich am Kernporenkomplex zersetzt.
Das virale Genom dringt in den Zellkern ein und wandelt sich in kovalent geschlossene zirkuläre DNA oder cccDNA um – eine stabile Matrize – die für virale Proteine, einschließlich Luciferase, kodiert.
Ernten Sie die Zellen in vordefinierten Intervallen und lysieren Sie, um intrazelluläre Luziferase freizusetzen.
Führen Sie ein Reportersubstrat ein. Luciferase oxidiert das Substrat und erzeugt ein Signal.
Ein Anstieg der Luciferase-Aktivität nach der Infektion deutet auf eine kontinuierliche Expression des viralen Genoms hin.
Platten-HepG2-Zellen, die stabil Natriumtaurocholat exprimieren, co-transportierendes Polypeptid oder NTCP sind, die anfällig für eine HBV-Infektion sind, und inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.
Einen Tag vor der Infektion werden ca. 5 x 104 HepG2/NTCP-Zellen in 0,1 Milliliter Kulturmedium in die Vertiefungen einer 96-Well-Kollagen-beschichteten Platte eingefüllt. Tauen Sie rekombinantes HPV in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf, bis ein kleines Stück Eis im Fläschchen verbleibt.
Bereiten Sie das Medium für die Infektion vor, indem Sie 78 Mikroliter frisches Nährmedium, zwei Mikroliter DMSO, 10 Mikroliter mit 40 % PEG8000 in 1X PBS und 10 Mikroliter rekombinantes HPV kombinieren. Geben Sie 100 Mikroliter rekombinante HBV-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
Verwenden Sie einen Tag nach der Infektion 300 Mikroliter PBS, um die Zelle dreimal zu waschen, um das kontaminierende Reporterprotein aus der Virusfraktion zu entfernen. Geben Sie 200 Mikroliter Kulturmedium mit 2 % DMSO zu den infizierten Zellen und inkubieren Sie eine Woche oder weniger.
Um eine Analyse der HBV-Infektion durchzuführen, verwenden Sie PBS, um die infizierten Zellen dreimal zu waschen. Geben Sie 50 Mikroliter Lysepuffer zu den infizierten Zellen. Schütteln Sie die Kulturplatte fünf Minuten lang und zentrifugieren Sie sie dann fünf Minuten lang bei 2000 mal g. Geben Sie 50 Mikroliter des Reportersubstrats auf eine Luminometerplatte, geben Sie dann 20 Mikroliter des Zelllysats auf die Platte und mischen Sie durch kurzes Schütteln. Setzen Sie abschließend die Platte in das Luminometer ein und starten Sie die Ablesung.
Übersicht
Diese Studie untersucht den Infektionsmechanismus des Hepatitis-B-Virus (HBV) in menschlichen Leberkrebszellen, die genetisch modifiziert wurden, um das Natrium-Taurocholat-Cotransport-Polypeptid (NTCP) zu exprimieren. Die Forschung unterstreicht die Rolle von NTCP bei der Förderung des HBV-Eintritts und der anschließenden Expression viraler Proteine.
Wichtige Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Virologie
- Zellbiologie
- Onkologie
Hintergrund
- Das Hepatitis-B-Virus ist ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem.
- NTCP ist ein Rezeptor, der die Eintritt von HBV in Leberzellen vermittelt.
- Das Verständnis der Infektionsmechanismen von HBV kann bei der Entwicklung therapeutischer Strategien helfen.
- Luciferase-Reportergene werden verwendet, um die virale Aktivität zu messen.
Zweck der Studie
- Aufklärung der Rolle von NTCP bei der HBV-Infektion.
- Beurteilung der Expression des viralen Genoms nach der Infektion.
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung von HBV in vitro.
Verwendete Methoden
- Kultur von HepG2-Zellen, die NTCP exprimieren.
- Infektion mit rekombinantem HBV, das ein Luciferase-Reportergen enthält.
- Zelllyse und Messung der Luciferase-Aktivität.
- Verwendung von PBS und Lysepuffer zur Zellverarbeitung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Infektion von HepG2/NTCP-Zellen durch HBV.
- Erhöhte Luciferase-Aktivität weist auf eine andauernde virale Genomexpression hin.
- Die Interaktion von NTCP mit HBV erleichtert den viralen Eintritt in Wirtszellen.
- Luciferase-Assays liefern eine quantitative Messung der HBV-Infektion.
Schlussfolgerungen
- NTCP ist für den HBV-Eintritt in Leberzellen unerlässlich.
- Luciferase-Reportergen-Assays eignen sich effektiv zur Untersuchung der HBV-Dynamik.
- Dieses Modell kann für zukünftige HBV-Forschung und Arzneimitteltests verwendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die quantitative Detektion einer Hepatitis-B-Virus-(HBV-)Infektion mithilfe eines rekombinanten Luciferase-Reportersystems ermöglicht eine präzise Messung früher Ereignisse des viralen Eintritts und der Replikation in menschlichen Leberzellen. Diese Fähigkeit unterstützt eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Zielvalidierung und der mechanistischen Risikominderung in antiviralen Entdeckungspipelines. Das System bietet eine skalierbare, reproduzierbare Plattform zur Untersuchung von HBV-Wirts-Interaktionen und zum Screening von potenziellen therapeutischen Ansätzen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der HBV-Entrittsmechanismen über die Bindung an den NTCP-Rezeptor.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Wirt-Virus-Interaktionen, die für die therapeutische Zielstruktur wichtig sind.
- Erleichtert die mechanistische Risikominderung, indem frühe Infektionsereignisse von nachgeschalteten Replikationsprozessen abgegrenzt werden.
- Liefert quantitative Messgrößen für die hypothesengetriebene Priorisierung von Zielstrukturen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert einen validierten, reproduzierbaren zellbasierten Test zur Detektion von HBV-Infektionen.
- Erzeugt robuste, quantitative Luciferase-Signale, die für Hochdurchsatz-Screenings geeignet sind.
- Standardisiert die Messung der Infektion und ermöglicht eine zuverlässige Bewertung von Substanzen sowie die Übertragbarkeit des Assays.
- Ermöglicht eine Skalierung für das Screening von Bibliotheken, die auf den viralen Eintritt oder die Replikation abzielen.
Translationale und präklinische Forschung
- Passt die Dynamik der In-vitro-Infektion an krankheitsrelevante Wirtszellmodelle an.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der mechanistischen Entdeckung zur präklinischen Validierung von antiviralen Kandidaten.
- Bietet eine Plattform zur Bewertung translationaler Biomarker der HBV-Infektion, sofern durch zusätzliche Endpunkte unterstützt.
- Reduziert das biologische Risiko durch Klärung früher virus-wirtsspezifischer Wechselwirkungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses rekombinante Virus-Reportersystem integriert sich in den Bereich zwischen früher Entdeckung und Identifizierung von Wirkstoffkandidaten und unterstützt sowohl mechanistische Untersuchungen als auch Screening-Arbeitsabläufe in der HBV-Forschung.
- Entdeckungsbiochemie: Quantifiziert den viralen Eintritt und die frühe Replikation und klärt so die NTCP-vermittelten Infektionswege auf.
- Screening: Bietet standardisierte, reproduzierbare Luciferase-basierte Messungen zur Beurteilung von Substanzen.
- Analytik: Ermöglicht empfindliche, quantitative Messungen der Infektionskinetik und den Vergleich verschiedener Bedingungen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die präklinische Kontinuität durch Modellierung der Infektion in menschlichen Leberzellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare und anpassbare Plattform für vielfältige HBV-Forschungs- und antivirale Screening-Anforderungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Zielvalidierung und das mechanistische Verständnis der HBV-Infektion.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Assays für Forschungs- und Entwicklungsteams.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich der Weiterentwicklung von Wirkstoffkandidaten und verringert biologische Risiken in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien antiviraler Portfolioprojekte.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von HBV-gerichteten Assets und den Fortschritt von Kandidaten.
Umsetzungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, Umgang mit Viren und lumineszenzbasierten Assays.
- Benötigt Zugang zu NTCP-exprimierenden HepG2-Zellen und rekombinantem HBV-Reporter-Virus.
- Setzt standardisierte Instrumente für die Detektion des Luciferase-Signals und die Datenanalyse voraus.
- Die Abstimmung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Assay-Protokolle und der Dateninterpretation ist für die Reproduzierbarkeit unerlässlich.
- Die Anpassung an andere virale Systeme kann zusätzliche Validierung und Optimierung erfordern.
Biopharma FAQs
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026