Messung der Migration natürlicher Killerzellen als Reaktion auf chemotaktische Reize

Beginnen Sie mit der Zugabe von Chemolockstoffen, wie z. B. einem Chemokin, in eine Multiwell-Platte.

Setzen Sie eine durchlässige Kammer mit geeigneter Porengröße in die Vertiefung ein. Geben Sie die natürliche Killer- oder NK-Zellsuspension in die obere Kammer und inkubieren Sie.

Einige wenige Chemokinmoleküle diffundieren durch die Membran und binden an NK-Zellrezeptoren. Dies löst Signalwege aus, die Veränderungen des Zytoskeletts fördern, was zu einer gerichteten Zellbewegung in Richtung der höheren Chemotraktorenkonzentration in der unteren Kammer führt.

Nach der Inkubation wird ein festes Volumen migrierter Zellen aus der unteren Kammer in ein fluoreszenzaktiviertes Zellsortier- oder FACS-Röhrchen überführt. Fügen Sie eine vorgegebene Anzahl von fluoreszierenden Zählkügelchen hinzu und führen Sie eine FACS-basierte Zellzählung durch.

Bestimmen Sie anhand der folgenden Formel die absolute Anzahl der migrierten NK-Zellen in der Stichprobe.

Das Punktdiagramm gibt die Anzahl der Zählkügelchen und Zellen an, die als unterschiedliche Bereiche getrennt sind, basierend auf ihren Fluoreszenz- und Streueigenschaften.

Um die Migration von NK-Zellen als Reaktion auf chemotaktische Stimuli zu messen, entnehmen Sie humane NK-Zellen aus einer konfluenten Kultur von 70 % bis 80 % und resuspendieren Sie die Zellen bei einer Konzentration von 2,5 x 10⁶ Zellen pro Milliliter serumfreiem NK-Zellkulturmedium. Fügen Sie als Nächstes 600 Mikroliter serumfreies Medium hinzu, das den interessierenden NK-Zell-Chemolockstoff pro Vertiefung enthält.

Und setzen Sie einen Kultureinsatz mit einem Durchmesser von 6,5 Millimetern und 5-Mikrometer-Poren in jede Vertiefung des Mediums ein. Geben Sie dann 100 Mikroliter NK-Zellen in das obere Fach jedes Einsatzes und legen Sie die Platte für vier Stunden in den Zellkultur-Inkubator.

Am Ende der Inkubation wird das gesamte Volumen der nicht adhärenten migrierten Zellen vom Boden jeder Vertiefung in einzelne 5-Milliliter-FACS-Röhrchen überführt und 15 Mikroliter einer vorgegebenen Anzahl von Durchflusszytometrie-Zählkgelchen in jedes Röhrchen gegeben. Bewerten Sie dann mit einem Durchflusszytometer jede Zellprobe gemäß den standardmäßigen durchflusszytometrischen Analyseprotokollen und berechnen Sie die absolute Anzahl der migrierten NK-Zellen anhand der Formel.