Analyse der Efferozytose apoptotischer Thymozyten mittels Peritonealmakrophagen

Efferozytose ist der Prozess, durch den phagozytische Zellen apoptotische Zellen beseitigen.

Um die Efferozytose zu analysieren, erhalten Sie Apoptose-empfindliche Maus-Thymozyten. Mit zellpermeablem CFSE-Farbstoff inkubieren.

Intrazelluläre Esterasen spalten CFSE an zellundurchlässigen Fluoreszenzfarbstoff und färben Thymozyten. Fügen Sie hitzeinaktiviertes Serum hinzu, um übermäßige Fleckenbildung zu vermeiden.

Plattieren Sie die gefärbten Thymozyten auf einer Kulturplatte. Fügen Sie Staurosporin hinzu, einen Proteinkinase-Inhibitor, der die kritische zelluläre Signalkaskade unterbricht und die Apoptose induziert. Darüber hinaus translozieren Phosphatidylserinreste in das äußere Segel der Zellmembran und fungieren als "Eat-me-Signale".

Erhöhen Sie die apoptotischen Thymozytenkonzentrationen zu Multi-Well-Plattenvertiefungen hinzufügen, die aktivierte Maus-Peritonealmakrophagen enthalten, die spezifische Rezeptor-Tyrosinkinasen exprimieren.

Diese Kinasen binden das exponierte Phosphatidylserin an apoptotische Thymozyten und erleichtern deren Internalisierung durch Makrophagen.

Nach der Inkubation frei schwebende apoptotische Thymozyten entfernen. Fügen Sie Fluorophor-markierte Anti-CD11b-Antikörper hinzu, die an Makrophagen-CD11b-Moleküle binden.

Beobachten Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop fluoreszierende apoptotische Thymozyten in unterschiedlich fluoreszierenden Makrophagen, was auf eine Efferozytose hinweist.

Vertiefungen mit höheren apoptotischen Thymozytenkonzentrationen weisen erhöhte internalisierte Thymozyten auf.

Um Thymozyten nach dem Öffnen der Brusthöhle einer naiven C57/Black-6-Maus zu gewinnen, verwenden Sie eine gebogene Pinzette mit feiner Spitze, um den Thymus herauszuziehen. Legen Sie das Organ in eine Gewebekulturschale mit 10 Millilitern RPMI-1640-Medium. Reiben Sie den gesamten Thymus gegen die mattierten Enden von 2 Objektträgern und filtrieren Sie die resultierende Gewebesuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Sammeln Sie die Thymozyten durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 40 Millilitern.

Nach der Zählung zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie bis zu 2 x 10⁸ Zellen in 20 Millilitern frischem PBS pro 50-Milliliter-Röhrchen. Markieren Sie die Zellen mit 5-mikromolarer CFSE in 20 Millilitern PBS pro Röhrchen. Drehen Sie die Röhrchen zwei- bis dreimal um, um sie zu mischen, bevor Sie die Thymozyten nicht länger als 2 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt inkubieren. Am Ende der Inkubation stoppen Sie die Reaktion mit 10 Millilitern hitzeinaktiviertem Pferdeserum und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Resuspendieren Sie die markierten Zellen in 40 Millilitern frischem PBS zum Zählen und Zentrifugieren, gefolgt von einer zusätzlichen Wäsche mit 40 Millilitern Medium. Nach der Mediumwäsche resuspendieren Sie die Thymozyten bei einer Konzentration von 7 x 10⁶ Zellen pro Milliliter Gewebekulturmedium und säen Sie die Zellen in einer 100-Millimeter-Gewebekulturschale aus. Geben Sie dann Staurosporin in einer Endkonzentration von 1 Mikromolar in die Zellkultur und stellen Sie die Platte für 4 Stunden in einen Gewebekultur-Inkubator.

Für die Isolierung von peritonealen Makrophagen injizieren Sie zwei C57/Black-6-Mäuse intraperitoneal mit 1 Milliliter 3% gealtertem Thioglykolat an Tag 0, bevor Sie an Tag 5 die Bauchhaut öffnen, ohne das Peritoneum zu stören.

Um die Bauchhöhle zu spülen, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 18-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um schnell 10 Milliliter Waschpuffer in die Kavität zu drücken, bevor Sie den Waschpuffer langsam ansaugen, um ihn in einem 50-Milliliter-Röhrchen zu sammeln. Waschen Sie die Peritonealsonde zweimal mit PBS. Resuspendieren Sie die Peritonealmakrophagen in einer Konzentration von 2 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter Gewebekulturmedium.

Als nächstes säen Sie 500 Mikroliter Makrophagen in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und legen Sie die Platte für 2 Stunden in einen Gewebekultur-Inkubator. Am Ende der Inkubation aspirieren Sie den Überstand, um die schwimmenden Zellen zu entfernen, und geben Sie 500 Mikroliter Gewebekulturmedium in jede Vertiefung

Geben Sie sofort 0 bis 12 x 10⁶ Thymozyten in 500 Mikroliter Medium in jede Vertiefung der Kultur und legen Sie die Platte für 4 Stunden in den Gewebekultur-Inkubator. Am Ende der Inkubation waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit frischem PBS, um alle frei schwebenden apoptotischen Zellen zu entfernen, gefolgt von einer einmaligen Wäsche mit Färbepuffer. Markieren Sie anschließend die plattengebundenen Makrophagen mit 200 Mikrolitern Färbepuffer, ergänzt mit einem geeigneten Anti-CD11b-Antikörper pro Well, und platzieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei 4 Grad Celsius.