JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 3:35 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie virulente und weniger virulente Staphylococcus aureus-Stämme.
Fügen Sie Serum hinzu, um die Bakterien zu opsonisieren.
Übertragen Sie steigende Bakterienkonzentrationen in gekühlte Multi-Well-Plattenvertiefungen, die Neutrophile enthalten. Niedrige Temperaturen verhindern die Aktivierung von Neutrophilen.
Zentrifuge zur Erleichterung der synchronisierten Phagozytose.
Neutrophile Rezeptoren binden die Opsonine und lösen so die bakterielle Internalisierung in Phagosomen aus.
Bei virulenten Bakterien löst das phagosomale Milieu die Expression von zytolytischen Toxinen aus.
Diese Toxine bilden Poren, zerstören die Phagosomen und beeinträchtigen die Integrität der Neutrophilenmembran.
Die weniger virulenten Bakterien weisen jedoch eine verminderte zytolytische Toxinexpression auf.
Nach der Inkubation werden die Neutrophilen abgenommen und in Durchflusszytometerröhrchen mit dem fluoreszierenden Propidiumiodid (PI)-Farbstoff übertragen.
Der Farbstoff dringt mit geschädigten Membranen in die Neutrophilen ein und färbt die DNA.
Analysieren Sie die Neutrophilen mit einem Durchflusszytometer auf PI-Färbung.
Ein konzentrationsabhängiger Anstieg des Anteils von PI-positiven Neutrophilen nach Phagozytose des virulenten Stammes im Vergleich zum weniger virulenten Stamm deutet auf die Zytotoxizität des virulenten Stammes gegen Neutrophile hin.
Wenn subkultivierter Staphylokokken aureus ein mittleres exponentielles Wachstum erreicht hat, übertragen Sie 1 Milliliter kultivierter Bakterien in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 5000 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie S. aureus, indem Sie den Überstand ansaugen, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie die pelletierten Bakterien in 1 Milliliter DPBS. Die Proben 30 Sekunden lang vortexen. Die Proben werden bei 5000 g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Um Staphylokokken aureus zu opsonisieren, resuspendieren Sie zunächst das Bakterienpellet in 1 Milliliter 20% Humanserum. Inkubieren Sie die Proben dann bei 37 Grad Celsius und rühren Sie 15 Minuten lang. Waschopsonisierter Staphylokokken aureus nach der Zentrifugation, wie oben gezeigt. Verdünnen Sie opsonisierte Staph aureus-Stämme auf 1 x 108 koloniebildende Einheiten, KBE pro Milliliter, mit eiskaltem RPMI. Die Probe 30 Sekunden lang vortexen und auf Eis legen.
Bestätigen Sie die Konzentrationen von Staphylokokken aureus, die für diese Assays verwendet werden, indem Sie 1 bis 10 serielle Verdünnungen von Bakterien auf Agar plattieren. Geben Sie vorsichtig 100 Mikroliter pro Vertiefung jedes Staph aureus-Stammes (RPMI) für Positiv- und Negativkontrollen zu PMNs in einer 96-Well-Platte auf Eis aus Schritt 1.14. Platte sanft rocken, um Staphylokokken aureus in Vertiefungen zu verteilen.
Synchronisieren Sie die Phagozytose, indem Sie die Platte bei 500 g acht Minuten lang bei 4 Grad Celsius zentrifugieren und die Platte bei 37 Grad Celsius inkubieren, unmittelbar nach der Zentrifugation als Zeit 0. Legen Sie die Platte zu den gewünschten Zeitpunkten auf Eis und geben Sie 200 Mikroliter eiskaltes DPBS mit 1 Mikroliter Propidiumiodid in jedes Durchflusszytometrieröhrchen, dann übertragen Sie die Proben in das entsprechende Röhrchen.