Reporter-Enzym-Fluoreszenz-Bildgebung für die In-vivo-Verfolgung bakterieller Infektionen

Setzen Sie eine Maus Aerosoltröpfchen aus, die Mycobacterium tuberculosis enthalten.

Bakterien gelangen in das Lumen der Lungenbläschen – die winzigen Luftsäcke in der Lunge – in denen sich Makrophagen befinden.

Makrophagen-Mustererkennungsrezeptoren binden an die erregerassoziierten molekularen Muster auf den Bakterien und lösen deren Einbindung in ein Phagosom aus.

Verschlungene Bakterien sezernieren spezialisierte Proteine, die die Phagosomenmembran aufbrechen. Die Bakterien entweichen in das Zytoplasma und vermehren sich.

Betäuben Sie die Maus nach der Infektion. Intraperitoneal wird ein Reportersubstrat des bakteriellen β-Lactamase-Enzyms für die Fluoreszenz- oder REF-Bildgebung des Reporterenzyms verabreicht.

Das Substrat gelangt über den Blutkreislauf in die Lungenbläschen und gelangt in die infizierten Zellen.

Es dringt in die bakterielle Außenmembran ein und gelangt in den periplasmatischen Raum, der β-Lactamase enthält.

Das Substrat enthält einen β-Lactam-Ring, der ein Fluorochrom und einen Quencher verbindet. Aufgrund der Nähe wird die Fluoreszenz des Fluorochroms vom Quencher absorbiert.

β-Lactamase hydrolysiert den β-Lactam-Ring, setzt das Fluorophor frei und führt zu einer Fluoreszenzemission.

Bilde die Fluoreszenz ab, um eine mykobakterielle Infektion zu beurteilen.

Um fortzufahren, laden Sie Tiere mit bekanntem Gewicht in die eingeschaltete Impfkammer. Die Kammer bietet Platz für bis zu 90 Mäuse. Schließen Sie dann alle Riegel an der Tür. Schließen Sie anschließend den Vernebler mit einer Stahlklemme an. Drücken Sie dann den Startknopf an der Kammer und stellen Sie den Luftdurchsatz auf 3 bis 5 Liter pro Minute ein.

Die Druckluft strömt mit etwa 22 bis 26 Pfund pro Quadratzoll, und vor allem sollte es möglich sein, den Nebel des Inokulums in der Kammer zu sehen. Nach 15 Minuten leuchtet ein rotes Licht an der Vorderseite des Bedienfelds auf und ein akustisches Signal zeigt das Ende des Laufs an. Drücken Sie dann die Reset-Taste, um die Timer zurückzusetzen. Um das Vakuum zu lösen, drücken Sie den kleinen roten Knopf an der Tür der Kammer.

Öffnen Sie dann die Kammertür und bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige zurück. Halten Sie die Tiere in Zukunft im Sicherheitsraum. Stellen Sie anschließend das Glas im Transportbehälter wieder in die Biosicherheitswerkbank zurück. Entsorgen Sie dort die restliche Bakteriensuspension in einem dafür vorgesehenen Abfallbehälter. Legen Sie dann das gebrauchte Verneblerglas in einen Biohazard-Beutel und verschließen Sie den Beutel für den Transport in den Autoklaven.

Um die Kammer zu reinigen, besprühen Sie die Innenflächen mit gepuffertem Phenol und 70% Ethanol. Lassen Sie diese Lösungen 10 Minuten lang auf diesen Oberflächen einwirken und wischen Sie sie dann gründlich ab. Entsorgen Sie alle Tücher im Müll für biologische Gefahren. Autoklavieren Sie dann den Müll, den Abfallbehälter und die gebrauchten Verneblergläser.

Bringen Sie die Tiere in den Bildgebungsraum. Dort wird ein Tier nach dem Textprotokoll betäubt und durch intraperitoneale Injektion mit Kontrastsubstrat injiziert. Initialisieren Sie das System in der Imaging-Systemsoftware und fahren Sie fort, wenn der Temperaturbalken grün wird. Platzieren Sie die Maus nach der Initialisierung des Systems in der Bildgebungskammer.

Stellen Sie sicher, dass sich die Nasenlöcher innerhalb des Nasenkegels befinden, damit er während der Bildgebung betäubt wird. Kehren Sie nun zum Computer zurück. Wählen Sie im Bedienfeld für die Erfassung entweder Fluoreszenz, Transillumination für die Ganztiervisualisierung oder Epi-Illumination für die Anzeige von Lungengewebe. Stellen Sie für eine einzelne Maus das Sichtfeld auf B und die Lampenstärke auf hoch ein.

Verwenden Sie für die Belichtung die automatische Zeit, das mittlere Binning und zwei oder drei für die Blende. Stellen Sie dann den Anregungsfilter auf 745 Nanometer und die Emissionsfilter auf 780 bis 840 Nanometer ein. Gehen Sie als Nächstes zu Sequenz einrichten und wählen Sie 9 bis 12 Transilluminationspunkte im Interessenbereich aus. Drücken Sie nun die Acquire-Taste, um Bilder zu sammeln.