Ein bakterieller Infektionsassay zur Untersuchung anaerober Bakterien-Wirtszell-Interaktionen

Beginnen Sie mit einer Kultur von Endothelzellen.

Ersetzen Sie das Medium durch anaerobe Medien. Inkubieren Sie in einer anaeroben Kammer zum Temperaturausgleich.

Porphyromonas gingivalis, ein pathogenes anaerobes Bakterium, zugeben und kurz inkubieren.

Die Bakterien besitzen proteinöse Fortsätze, sogenannte Fimbrien, die an spezifische Adhäsionsmoleküle auf den Endothelzellen binden und so die Adhärenz der Bakterien erleichtern.

Diese Bindung löst intrazelluläre Signalkaskaden aus, die zu einer Umlagerung des Aktin-Zytoskeletts und einer bakteriellen Internalisierung in Phagosomen führen.

Nach der Inkubation Medien entfernen. Mit einem anaeroben Puffer waschen, um nicht anhaftende extrazelluläre Bakterien zu entfernen.

Fügen Sie ein mildes Detergens hinzu, um die Wirtszellmembranen zu permeabilisieren und die Zelllyse zu induzieren, wodurch internalisierte und oberflächengebundene Bakterien freigesetzt werden, ohne Schäden zu verursachen.

Verdünnen Sie die lysathaltigen Bakterien mit Medien und bereiten Sie serielle Verdünnungen vor.

Plattieren Sie diese Verdünnungen auf Blutagarplatten. Unter anaeroben Bedingungen inkubieren, damit sich Porphyromonas gingivalis vermehren und Kolonien bilden kann.

Zählen Sie nach der Inkubation die koloniebildenden Einheiten (KBE) auf jeder Platte, um oberflächengebundene und internalisierte Bakterien zu quantifizieren, was auf Bakterien-Wirtszell-Interaktionen hinweist.

Für die Kultivierung und das Experimentieren mit Porphyromonas gingivalis wird eine anaerobe Vinylkammer mit einer künstlichen Atmosphäre unterhalten, die 80 % Stickstoff, 10 % Wasserstoff und 10 % Kohlendioxid enthält.

Legen Sie 30 Blutagarplatten, 500 Milliliter PBS und Milliliter des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors oder VEGF-Mediums 24 Stunden im Voraus in die anaerobe Kammer, um die Reagenzien auszugleichen.

Säen Sie 4 mal 10 in die 5 menschlichen Nabelvenendothelzellen (HUVECs) pro Vertiefung in Sechs-Well-Platten in VEGF-Medium und lassen Sie sie über Nacht im Zellkultur-Inkubator zur Anheftung. Bereiten Sie Porphyromonas gingivalis-Kulturen in Gehirn-Herz-Infusion oder BHI-Medium vor, wie im Begleittext beschrieben, und lassen Sie die Kulturen die logarithmische Phase erreichen, während die optische Dichte der Kultur bei 660 Nanometern zwischen 0,5 und 0,7 liegt.

Übertragen Sie die Bakterien in ein 15-Milliliter-Röhrchen und wickeln Sie ein Stück Parafilm um die Kappe, um eine aerobe Exposition zu verhindern. Zentrifugieren Sie dann die Bakterien 10 Minuten lang bei 5.000 mal g. Waschen Sie die pelletierten Bakterien in der anaeroben Kammer mit anaerobem PBS und schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 5.000 g zurück. Resuspendieren Sie die Bakterien in VEGF-Medium.

Um die HUVECs mit Porphyromonas gingivalis zu infizieren, überführen Sie die Sechs-Well-Platten aus dem Inkubator in die anaerobe Kammer. Saugen Sie das Medium aus den Testvertiefungen an und waschen Sie es dreimal mit anaerobem PBS.

Bestimmen Sie die Zellzahl aus einer repräsentativen Vertiefung mit Hilfe eines Trypanblau-Ausschlussassays. Fügen Sie dann 2 Milliliter anaerobes VEGF-Medium pro Vertiefung hinzu und legen Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten in den anaeroben Inkubator, um sie auszugleichen.

Bestimmen Sie die optische Dichte der Bakterien und resuspendieren Sie sie in einem ausreichenden Volumen des VEGF-Mediums, um Zellen bei einer Infektionsvielfalt von 100 zu 1 Bakterien-zu-Zelle-Verhältnis zu infizieren. Geben Sie die Bakteriensuspension in die Zellen und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius für eine Infektion. Für die Zelllyse wird in der anaeroben Kammer eine Saponinlösung mit 1 Gew.-% pro Volumen in BHI-Medium hergestellt und durch einen 0,2-Mikron-Filter filtriert.

Um bakterielle Wechselwirkungen mit Wirtszellen zu untersuchen, nehmen Sie die Sechs-Well-Platte aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Infektionsmedium. Dreimal mit anaerobem PBS waschen. Geben Sie dann 2 Milliliter Saponinlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang, um die Zelllyse zu ermöglichen.

Kratzen Sie dann die Zellen vom Boden der Vertiefung ab und verdünnen Sie das Zelllysat 1 zu 1 mit BHI-Medium. Führen Sie dann serielle Verdünnungen von 1 bis 100 durch. Platte 200 Mikroliter einer geeigneten Verdünnung auf Blutagarplatten. Wickeln Sie die Platten mit Parafilm ein und inkubieren Sie sie sieben Tage lang in einem anaeroben Inkubator bei 37 Grad Celsius, um die Koloniebildung zu ermöglichen. Zählen Sie dann mit einem Leuchtkasten die koloniebildenden Einheiten (KBE) auf jeder Platte.