Visualisierung von internalisierten anaeroben Bakterien in Wirtsendothelzellen

Beginnen Sie mit einer Suspension von aktiv wachsenden Porphyromonas gingivalis, anaeroben pathogenen Bakterien.

Fügen Sie BCECF-AM hinzu, einen nicht fluoreszierenden, zelldurchlässigen Farbstoff.

Aktive zytoplasmatische Esterasen hydrolysieren den Farbstoff in eine fluoreszierende, zellundurchlässige Form und färben die Bakterien.

Zentrifuge. Resuspendieren Sie die Bakterien in anaeroben Medien.

Geben Sie die markierten Bakterien in Multi-Well-Plattenvertiefungen, die Deckgläser mit anhaftenden menschlichen Endothelzellen enthalten.

In einer anaeroben Kammer inkubieren.

Die bakteriellen Fimbrien binden an die Oberflächenrezeptoren der Endothelzellen und setzen so intrazelluläre Signalkaskaden in Gang.

Dies führt zu einer Umlagerung von Aktinen und einer bakteriellen Internalisierung innerhalb der Phagosomen.

Waschen Sie die Deckgläser nach der Inkubation mit Puffer, um nicht internalisierte Bakterien zu entfernen.

Fixieren Sie die Zellen mit Paraformaldehyd, um die Zellstrukturen zu erhalten. Permeabilisieren Sie die Zellen mit einem nichtionischen Detergens, um Zugang zu intrazellulären Zielen zu erhalten.

Fügen Sie fluoreszenzmarkiertes Phalloidin hinzu, das an die Aktinfilamente bindet.

Legen Sie das Deckglas über ein Eindeckmedium, das DAPI enthält, das die DNA verfärbt.

Beobachten Sie den fluoreszierenden Porphyromonas gingivalis in Endothelzellen mit fluoreszierendem Aktin, was die bakterielle Internalisierung bestätigt.

Um internalisierte Bakterien sichtbar zu machen, werden zunächst autoklavierte Glasdeckgläser aseptisch in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte übertragen. Fünfmal 10 in die vier HUVECs pro Vertiefung auf dem Deckglas plättieren und 24 Stunden lang inkubieren. Um Bakterien zu markieren, zentrifugieren Sie Bakterien in der Mitte der logarithmischen Phase und resuspendieren Sie das Pellet mit anaerobem PBS. Zentrifugieren Sie erneut und wiederholen Sie den Waschschritt.

Fügen Sie 20 Mikroliter 0,2 Millimolare BCECF-AM zu zwei Millilitern anaerobem PBS hinzu, das fünf bis sieben mal 10 bis das achte Bakterium pro Milliliter enthält. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten im Dunkeln.

Der von uns verwendete Fluoreszenzfarbstoff kann die meisten anaeroben Bakterien färben. Somit sind keine weiteren Reagenzien, wie z.B. ein spezifischer Antikörper, erforderlich.

Zentrifugieren Sie die Bakteriensuspension 10 Minuten lang bei 5.000-mal g, um das ungebundene Markierungsreagenz zu entfernen, und resuspendieren Sie die Bakterien in VEGF-Medium. Infizieren Sie dann die HUVEC-Zellen im Verhältnis 100 zu 1, Bakterien zu Zellen, und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation das Infektionsmedium und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Fügen Sie dann 4 % Paraformaldehyd hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellen in der anaeroben Kammer zu fixieren.

Entfernen Sie die fixierten Zellen aus der Kammer und waschen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS. Inkubieren Sie die Deckgläser in einem Milliliter 0,2 % Triton X-100 für 10 Minuten, um die Zellen zu permeabilisieren. Waschen Sie dann die Deckgläser dreimal mit PBS. Geben Sie nun 50 Mikroliter von 50 Mikrogramm pro Milliliter TRITC-Phalloidin zu jedem Deckglas und inkubieren Sie es 45 Minuten lang bei Raumtemperatur, um zelluläres oligomeres Aktin zu färben.

Waschen Sie das Deckglas nach der Inkubation dreimal mit PBS. Drehen Sie das Deckglas auf einem Objektträger mit weichem Eindeckmedium um, das ein Mikrogramm pro Milliliter DAPI enthält, um die Kernfärbung zu ermöglichen. Versiegeln Sie dann den Rand des Deckglases mit Nagellack und beobachten Sie ihn unter konfokaler Mikroskopie.