JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 4:29 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte, die eine Streptococcus pneumoniae-Suspension enthält.
Einführung von Antikörpern gegen bakterielle Oberflächenantigene, die mit bakteriellen Oberflächenantigenen interagieren. Dabei werden die Bakterien mit Antikörpern überzogen, wodurch opsonisierte Bakterien zur Immunerkennung entstehen.
Besiedeln Sie die Vertiefungen mit Neutrophilen aus dem peripheren Blut des menschlichen peripheren Blutes, die mit Kaninchenserum ergänzt werden, das Komplementproteine enthält.
Während der Inkubation lagern sich die Komplementproteine wie C3b auf der Bakterienoberfläche ab, was zu einer zusätzlichen Opsonin-Beschichtung auf den Antikörper-Opsonin-Bakterien führt – was die bakterielle Erkennung durch Neutrophile verbessert.
Die spezifischen Oberflächenrezeptoren auf den Neutrophilen interagieren mit den Opsoninen auf den Bakterien und erleichtern so die bakterielle Verschlingung durch Phagozytose.
Im Inneren des Phagosoms bauen Neutrophile die verschlungenen Bakterien ab, wodurch die Keimzahl im Puffer reduziert wird.
Nach der Inkubation die verdünnte Co-Kulturlösung auf eine Blutagarplatte auftragen, damit einzelne Bakterien Kolonien bilden können.
Vergleichen Sie die Anzahl der Kolonien in mit Opsonin behandelten Bakterien mit unbehandelten Bakterien.
Weniger Kolonien mit Opsonin-Behandlung deuten auf eine höhere bakterielle Abtötung hin, was auf eine erfolgreiche opsonophagozytäre Abtötung hindeutet.
Tauen Sie eine Tube Bakterienbrühe auf. Pelletieren Sie Bakterien bei 6.000 mal g für zwei Minuten und resuspendieren Sie das Zellpellet in OBB in der optimalen Verdünnung, die Sie im vorherigen Schritt erhalten haben. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der resuspendierten bakteriellen Verdünnung pro Vertiefung in eine 96-Well-Zellkulturplatte mit rundem Boden. Geben Sie dann 20 Mikroliter eines geeigneten Antikörpers oder einer medikamentösen Behandlung in doppelter Ausführung in jede Versuchsvertiefung.
Verwenden Sie für Kontrollvertiefungen 1X PBS oder OBB, je nachdem, welcher Puffer für die Behandlungsvertiefungen verwendet wird. Die Probenplatte wird eine Stunde lang bei ca. 90 U/min bei Raumtemperatur geschüttelt.
Um die HL60-differenzierten Zellen zu ernten, die drei Tage zuvor mit DMF behandelt wurden, pelletieren Sie die Zellen drei Minuten lang mit 500-mal g. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit mindestens 10 Millilitern 1XPBS. Pelletieren Sie die gewaschenen Zellen drei Minuten lang bei 500 mal g. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in OBB.
Fügen Sie steriles, unverdünntes Kaninchenbaby-Serum mit einem Endvolumen von ein bis fünf hinzu. Teilen Sie nach einer einstündigen Bakterienkultur jede Probe in doppelte Vertiefungen für zwei Gruppen auf. Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter der HL60-Komplementmischung in jeden Versuchssatz von Vertiefungen und 50 Mikroliter OBB nur in die Vertiefungen von Bakterien hinzu. Schütteln Sie die 96-Well-Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.
Um die Proben zu plattieren, verdünnen Sie jede Vertiefung mit OBB bei einem Endvolumen von ein bis fünf, so dass jede Probe ein Volumen von mindestens 50 Mikrolitern hat. Pipettieren Sie anschließend 50 Mikroliter jeder Probe direkt auf einen bestimmten Bereich einer Bakterienkulturplatte, wobei Sie auf einen ausreichenden Abstand zwischen den Proben achten. Die Proben abdecken und etwa 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen.
Die Platten umdrehen und über Nacht bei 30 Grad Celsius kultivieren. Alternativ können Kulturplatten in anaeroben Gläsern verwendet werden, um zu testen, ob anoxische Bedingungen das Bakterienwachstum beeinflussen, oder um die Morphologie zu kontrollieren. Nach der Kultur über Nacht werden die Kolonien in jedem ausgewiesenen Probenbereich gezählt und mit der Datenanalyse fortgefahren, indem die Anzahl der lebenden Zellen in jedem Satz mit den entsprechenden Kontrollen verglichen wird.
Die schwierigsten Aspekte bei der erstmaligen Etablierung dieser Technik werden wahrscheinlich darin bestehen, die Ausgangs-KBE des Bakterienbestands zu optimieren und sicherzustellen, dass die HL60-Zellen effektiv differenziert sind.