Durchflusszytometrische Färbung von Mycobacterium tuberculosis-infizierten Makrophagen-Subpopulationen

Beginnen Sie mit adhärenten M1- und M2-Makrophagen-Subpopulationen, die sich durch ihre spezifischen Oberflächenmarker unterscheiden. Diese Zellen sind mit dem fluoreszenzmarkierten Mycobacterium tuberculosis infiziert.

Geben Sie FACS-Puffer in die Kulturvertiefungen.

EDTA im Puffer ermöglicht die Zellablösung aus den Kulturvertiefungen.

Übertragen Sie die Zellsuspension in Mikrozentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Fluorochrom-konjugierten Anti-Makrophagen-Antikörper-Cocktail und einem Viabilitätsfarbstoff, Zombie-UV.

Der Zombie-UV-Fluoreszenzfarbstoff dringt durch geschädigte Membranen in tote Zellen ein und bindet an zytoplasmatische Proteine, wodurch eine klare Unterscheidung von lebensfähigen ungefärbten Zellen ermöglicht wird.

Darüber hinaus binden die fluoreszierend konjugierten Anti-Makrophagen-Antikörper an Zielantigene auf den Makrophagen, was einen unterschiedlichen Nachweis von Subpopulationen ermöglicht.

Waschen Sie die Zellen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Zentrifuge. Entfernen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie die Zellen in einem Fixierpuffer, um Proteine zu vernetzen, die Zellmorphologie zu erhalten und Mykobakterien für eine sichere Handhabung während der Analyse zu inaktivieren.

Zum Schluss zentrifugieren und verarbeiten Sie die Proben für die Durchflusszytometrie.

Verwenden Sie eine geeignete Gating-Strategie, um den Prozentsatz der mit Mycobacterium infizierten Subpopulationen zu bestimmen.

Um die Zellen für die Durchflusszytometrie zu färben, inkubieren Sie die infizierten Zellen mindestens 30 Minuten lang mit 1 Milliliter FACS-Puffer, ergänzt mit 0,5 millimolar EDTA pro Well. Am Ende der Inkubation sammeln Sie die abgelösten Zellen durch vorsichtiges Pipettieren und überführen Sie die Zellen zur Zentrifugation in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss.

Resuspendieren Sie die Zellen in etwa 50 Mikrolitern Fluorochrom-konjugiertem Anti-Human-Antikörper-Cocktail und Viabilitätsfarbstoff von Interesse und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius lichtgeschützt.

Fixieren Sie die Zellen nach dem Waschen mit 200 Mikrolitern frisch zubereitetem Fixierpuffer für 30 Minuten bei Lichtschutz bei Raumtemperatur. Nach der Fixierung und dem Waschen resuspendieren Sie die Zellen in 400 Mikrolitern FACS-Puffer und überführen Sie die Zellen in 1-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Um die Zellen zu analysieren, verwenden Sie Kompensationsbeads, um das Fluoreszenzsignal für jeden Fluorochrom-konjugierten Antikörper im Cocktail zu kompensieren, und verwenden Sie ungefärbte Zellen, um das Gate für die negative Zellpopulation zu setzen. Erfassen Sie dann mindestens 50.000 Zellen pro Probe.